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SDS-PAGE蛋白凝膠電泳原理和實(shí)驗(yàn)步驟

蛋白凝膠電泳（SDS-PAGE）是一種在進(jìn)行下游檢測或分析前分離蛋白混合物的簡單方法。我們提供高效的蛋白凝膠電泳方案，涵蓋蛋白分析實(shí)驗(yàn)所需的蛋白預(yù)制膠、電泳槽、手灌膠系統(tǒng)、染料、蛋白Marker、電泳緩沖液、電泳儀電源和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)等產(chǎn)品。

賽默飛提供多種SDS-PAGE蛋白凝膠電泳產(chǎn)品，請?jiān)L問獲取產(chǎn)品最新信息。

什么是SDS-PAGE蛋白凝膠電泳？

蛋白凝膠電泳是一種在進(jìn)行下游檢測或分析前分離蛋白混合物的常規(guī)方法，在提取、鑒定和表征蛋白的眾多工作流程中，蛋白凝膠電泳是非常關(guān)鍵的一個(gè)步驟。

電泳是指溶液中的帶電顆粒在電場作用下發(fā)生移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳是一種可對蛋白和核酸進(jìn)行簡單、快速、靈敏的分離與分析的手段。任何帶電離子或顆粒在電場作用下都會(huì)發(fā)生移動(dòng)。多數(shù)生物分子在等電點(diǎn)以外的任何 pH 值下都帶有凈電荷，并且移動(dòng)速度與電荷密度成正比。

賽默飛蛋白預(yù)制膠套裝

凝膠基質(zhì)

常用于電泳的基質(zhì)有兩種：聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠。這兩種基質(zhì)屬于多孔介質(zhì)，作用類似于分子篩。分子的分離度取決于基質(zhì)的凝膠孔徑大小。瓊脂糖具有大孔徑，是分離核酸和蛋白復(fù)合物等大分子的理想基質(zhì)。聚丙烯酰胺的孔徑較小，更適合分離大多數(shù)蛋白、肽段和較小的核酸。

聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體聚合而成。這些單體在添加了能與鏈末端的自由官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的雙官能團(tuán)化合物（如N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺，bis）后，可交聯(lián)成長鏈。凝膠的孔徑大小取決于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的濃度。丙烯酰胺的濃度越高，凝膠孔徑越小，這有助于提高低分子量分子的分辨率，反之亦然。

聚丙烯酰胺凝膠電泳可通過調(diào)整如下條件，根據(jù)不同應(yīng)用需求來分離蛋白：

• 丙烯酰胺基質(zhì)

• 緩沖液系統(tǒng)

• 電泳條件

丙烯酰胺基質(zhì)

線性凝膠與梯度凝膠

具有單一丙烯酰胺百分比濃度的凝膠稱為線性凝膠，丙烯酰胺濃度是某一范圍的凝膠稱為梯度凝膠。梯度凝膠相較于線性凝膠的優(yōu)勢為可在更寬的分子量范圍內(nèi)均勻地分離蛋白。

連續(xù)凝膠與非連續(xù)凝膠

研究人員有時(shí)會(huì)將凝膠分為連續(xù)凝膠和非連續(xù)凝膠。連續(xù)凝膠是在整個(gè)凝膠盒中采用單一丙烯酰胺溶液制作而成的凝膠。非連續(xù)凝膠則采用兩種丙烯酰胺溶液制備：少量的低百分比濃縮膠（其中預(yù)留蛋白上樣孔），以及大量的用于分離蛋白的分離膠。在傳統(tǒng)的 Tris-甘氨酸蛋白凝膠系統(tǒng)中，濃縮膠位于高電泳遷移率的前導(dǎo)氯離子（存在于凝膠緩沖液中）與低電泳遷移率的甘氨酸尾隨離子（存在于電泳緩沖液中）之間，蛋白在該濃縮膠中進(jìn)行堆積。使用濃縮膠主要是為了提高凝膠中蛋白條帶的分辨率。這些堆積的蛋白條帶在進(jìn)入分離膠后開始進(jìn)行篩分。

小型蛋白凝膠與中型蛋白凝膠

我們提供兩種規(guī)格的即用型預(yù)制膠：小型膠和中型膠。兩種凝膠的電泳距離相同，但中型膠的尺寸更寬，因此上樣孔數(shù)量更多或上樣孔容量更大。中型膠中額外增加的上樣孔數(shù)量或孔徑，可以容納更多樣本數(shù)量或更高的樣品體積。

緩沖液系統(tǒng)

電泳需要在連續(xù)或不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)中進(jìn)行。連續(xù)緩沖系統(tǒng)使用同一種凝膠緩沖液和電泳緩沖液。不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)使用不同的凝膠緩沖液和電泳緩沖液[1]。不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)還可以使用兩層孔徑不同、緩沖液組分不同的凝膠層（濃縮膠和分離膠）。使用不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行電泳可使樣品在濃縮膠中堆積，從而獲得更高的分辨率。

電泳條件

蛋白的分離方式取決于使用的電泳條件，下面介紹一些常見條件。

變性條件 (SDS-PAGE)

變性電泳是在使用陰離子去垢劑如十二烷基硫酸鈉 (SDS)進(jìn)行變性的條件下進(jìn)行的電泳。SDS 通過包裹疏水部分使蛋白變性并展開。SDS 以 1 g 蛋白對應(yīng) 1.4 g SDS 的比率結(jié)合。得到的 SDS-蛋白復(fù)合物帶負(fù)電，按照分子大小在凝膠中分離。

非變性條件（天然 PAGE）

電泳是在非變性（天然）條件下，使用可以維持天然蛋白構(gòu)象、亞基相互作用和生物學(xué)活性的緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行的電泳。在天然電泳過程中，蛋白的分離基于荷質(zhì)比。

還原條件

使用還原劑，例如二硫蘇糖醇 (DTT)、β-巰基乙醇 (β-ME)或鹽酸三-(2-羧乙基)膦 (TCEP) 在還原條件下進(jìn)行電泳。還原劑切割半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，將變性的蛋白展開，分解成亞基。

1D 和 2D PAGE 對比

蛋白凝膠電泳最常見的形式是采用一維 (1D) 電泳對多個(gè)樣品進(jìn)行比較分析。具體流程為：將樣品加入上樣孔中，施加電流分離蛋白，然后通過染色或免疫印跡將蛋白條帶的遷移

情況可視化。

使用二維電泳 (2D-PAGE) 可以對單個(gè)樣品的多個(gè)成分進(jìn)行解析。第一向等電聚焦 (IEF) 電泳根據(jù)蛋白的天然等電點(diǎn) (pI) 分離蛋白。第二向電泳采用常規(guī)的 SDS-PAGE 根據(jù)分子量分離蛋白。2D-PAGE 可以為蛋白分析提供最高的分辨率，是蛋白組學(xué)研究中的一項(xiàng)重要技術(shù)。在這類研究中，有時(shí)需要在單塊凝膠上解析成千上萬種蛋白。

蛋白凝膠系統(tǒng)介紹

PAGE 利用不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)，在開始電泳時(shí)將樣品濃縮或“堆積"到濃縮膠中非常窄的區(qū)域內(nèi)。在不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)中，凝膠中的主要陰離子與電泳緩沖液中的主要陰離子不同（或不連續(xù)）。Invitrogen™ Bolt™ Bis-Tris Plus 預(yù)制膠，Invitrogen™ NuPAGE™ Bis-Tris 和 Tris-乙酸預(yù)制膠，以及基于 Laemmli 系統(tǒng)的 Invitrogen™ Novex™ Tris-甘氨酸預(yù)制膠都是不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)，具有類似的工作方式。但是，由于不同系統(tǒng)中的離子組成，Bis-Tris 和 Tris-乙酸系統(tǒng)需要在較低的 pH 值下工作。

Tris-甘氨酸系統(tǒng)

Tris-甘氨酸系統(tǒng)（圖 1）主要包含如下三種離子：

圖 1.Tris-甘氨酸預(yù)制膠系統(tǒng)。凝膠緩沖液中的離子為 Tris 和氯離子 (pH 8.7)；電泳緩沖液中的離子為 Tris、甘氨酸和 SDS (pH 8.3) ；凝膠的工作 pH 值為 9.5。

· 凝膠緩沖液提供的氯化物 (–) 離子，作為前導(dǎo)離子(快離子)，因?yàn)橄鄬τ谙到y(tǒng)中的其它陰離子，它對陽極的吸引力最高。

· 電泳緩沖液提供的甘氨酸 (–) 離子，是系統(tǒng)中的主要陰離因?yàn)檫@些離子僅部分帶負(fù)電，并且在帶電環(huán)境中始終跟隨帶電量更高的氯離子，因此作為尾隨離子（慢離子）。

· Tris 堿 (+) 離子是一種在凝膠和電泳緩沖液中均存在的緩沖配對離子。電泳期間，Tris-甘氨酸系統(tǒng)中的凝膠和緩沖離子在凝膠的分離區(qū)域形成 pH 9.5 的工作環(huán)境。

Bis-Tris 系統(tǒng)

Bis-Tris 系統(tǒng)（圖 2）主要包含如下三種離子：

• 由凝膠緩沖液提供的氯離子 (–)，作為快速移動(dòng)的前導(dǎo)離子。

• MES 或 MOPS (–) 離子（取決于電泳緩沖液的選擇），作為尾隨離子。

– MES：2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸

– MOPS：3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸

• 電泳緩沖液中提供Tris (+) 離子，凝膠中存在的 Bis-Tris (+)離子則為緩沖配對離子。

組合使用 pH 值較低的凝膠緩沖液 (pH 6.4) 和電泳緩沖液(pH 7.3–7.7)，可在電泳過程中顯著降低工作 pH (pH 7.0)，從而實(shí)現(xiàn)更好的樣品完整性和凝膠穩(wěn)定性。

Tris-乙酸系統(tǒng)

Tris-乙酸系統(tǒng)（圖 3）主要包含如下三種離子：

• 乙酸根 (–) 離子，來自凝膠緩沖液的前導(dǎo)離子

• Tricine (–) 離子，來自電泳緩沖液的尾隨離子

• Tris (+) 離子，作為緩沖配對離子（凝膠和緩沖液中均存在）

該系統(tǒng)的工作 pH 值也比 Tris-甘氨酸系統(tǒng)低得多，從而減少了凝膠引發(fā)的蛋白修飾。

Tricine 系統(tǒng)

Tricine 系統(tǒng)是傳統(tǒng) Tris-甘氨酸凝膠系統(tǒng)的改進(jìn)版本，使用了不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)，專用于解析 2-20 kDa 范圍的低分子量蛋白。通過重新配制 Laemmli 電泳緩沖液，并使用Tricine 代替甘氨酸，使 SDS -多肽在緊隨前導(dǎo)離子前沿的位置形成，而不是與 SDS 前沿共同電泳，因此可以將它們分離為離散的條帶。

實(shí)現(xiàn)理想蛋白分離的產(chǎn)品

蛋白預(yù)制膠

優(yōu)化的蛋白凝膠體系，適用于寬范圍的蛋白靶點(diǎn)分析。每種體系均有齊全的濃度和孔數(shù)選擇，您也可選擇手灌膠系統(tǒng)來手工制備蛋白凝膠。

電泳緩沖液

SDS-PAGE蛋白凝膠電泳緩沖液、非變性電泳緩沖液，以及用于制備手灌膠、凝膠上樣、凝膠電泳和轉(zhuǎn)印的試劑。

蛋白Marker

預(yù)染、非預(yù)染和 western blot 顯影蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。適用于SDS-PAGE、蛋白免疫印跡（western blot）和等電聚焦電泳（IEF）等。

蛋白凝膠染料

蛋白染料種類齊全，滿足從快速染色到高靈敏度染色等應(yīng)用所需。

賽默飛高品質(zhì)蛋白電泳產(chǎn)品方案涵蓋蛋白凝膠、蛋白染料、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、電泳緩沖液和轉(zhuǎn)印設(shè)備等，可為您的不同實(shí)驗(yàn)需求提供針對性方案。

請?jiān)L問賽默飛，了解我們的蛋白電泳產(chǎn)品。