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sgRNA是什么？是否提供兩部分合成 gRNA？

sgRNA 代表單向?qū)?RNA，與傳統(tǒng)的天然化膿性鏈球菌 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)不同，其使用兩部分向?qū)?，其?CRISPR RNA (crRNA) 與 tracrRNA 雜交。sgRNA 將兩個(gè) RNA 結(jié)合成單個(gè)長(zhǎng) RNA。sgRNA 的長(zhǎng)度通常為 100 nt，可以從載體表達(dá)或化學(xué)合成。

由于與雙部分 gRNA相比，修飾的 sgRNA 在更多類型的細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的效率，因此 TrueGuide crRNA:tracrRNA 兩部分向?qū)?RNA 產(chǎn)品形式已停用。這使得我們能夠簡(jiǎn)化我們的合成 gRNA 產(chǎn)品，并專注于修飾的 sgRNA。

賽默飛提供適用于 CRISPR-Cas9 和篩選應(yīng)用的高質(zhì)量 gRNAs產(chǎn)品，請(qǐng)?jiān)L問獲取產(chǎn)品最新信息。

使用 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)敲除基因表達(dá)或敲入特定突變時(shí)，高質(zhì)量的向?qū)?RNAs (gRNAs) 的設(shè)計(jì)、產(chǎn)生和遞送是成功的關(guān)鍵。無論您是需要與 Truecut Cas9 蛋白質(zhì) 結(jié)合使用的即用型轉(zhuǎn)染 gRNAs，還是需要利用慢病毒將編輯工具遞送至難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或原代細(xì)胞，我們都能夠?yàn)槟峁┫嚓P(guān)產(chǎn)品。使用我們的 gRNA 基因搜索工具找到其中任何一種形式的預(yù)設(shè)計(jì) gRNAs，或者繼續(xù)通過下面的選擇指南獲取其他選擇。

對(duì)于功能基因組篩選，我們還將先進(jìn)的 gRNA 設(shè)計(jì)整合到 CRISPR 文庫中，以進(jìn)行高通量的陣列篩選或經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的混合篩選。

不同 CRISPR gRNA 形式的選擇指南：

· TrueGuide 合成 gRNA

· 為實(shí)現(xiàn)高效敲除，從我們的即用型轉(zhuǎn)染的 預(yù)設(shè)計(jì) sgRNA  庫中選擇

· 將您的定制序列上傳到我們的 定制 TrueGuide gRNA 訂購工具

· 使用  TrueDesign Genome Editor 設(shè)計(jì)您的定制編輯

· LentiArray 慢病毒 gRNA

· 從我們包裝成即用型慢病毒的預(yù)設(shè)計(jì) gRNA 目錄中選擇您需要的 gRNA

· 適用于單個(gè)構(gòu)建體或篩選文庫

· 我們還提供定制慢病毒服務(wù)

· 精確 gRNA 合成試劑盒

· 一個(gè)利用 DNA 模板合成即用型轉(zhuǎn)染 gRNA 的完整試劑盒

搜索和訂購 gRNA 的快速工具

搜索預(yù)設(shè)計(jì)合成或慢病毒 CRISPR gRNA

TrueGuide 合成 gRNA 是即用型轉(zhuǎn)染 CRISPR 單鏈向?qū)?RNA (sgRNAs)，旨在為您所需的靶基因提供特異性和高效的敲除。如果您需要富集編輯的細(xì)胞、處理難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或需要長(zhǎng)期表達(dá) sgRNA，請(qǐng)使用我們的 LentiArray CRISPR gRNAs。

使用我們的基因搜索工具查找預(yù)設(shè)計(jì)的 TrueGuide gRNAs

使用我們的選擇工具查找預(yù)設(shè)計(jì)的 LentiArray CRISPR gRNAs

訂購定制合成 gRNA

您有自己的設(shè)計(jì)嗎？無論是來自期刊文章或同事，還是您最喜歡的設(shè)計(jì)工具，均可通過我們簡(jiǎn)單快速的界面上傳您想合成的定制 gRNA 序列至定制 TrueGuide gRNA。

使用我們的 TrueGuide 定制 gRNA 訂購工具輸入您自己的設(shè)計(jì)

使用我們的設(shè)計(jì)工具創(chuàng)建基因編輯實(shí)驗(yàn)和訂購您所需的 gRNAs

需要設(shè)計(jì)方面的幫助來構(gòu)建工程改造細(xì)胞系？您可以使用我們的免費(fèi)  TrueDesign Genome Editor 軟件設(shè)計(jì)您的 CRISPR 基因敲除、敲入或標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，和訂購一整套所需的試劑（包括 gRNAs）。

使用 TrueDesign Genome Editor 設(shè)計(jì)和訂購整個(gè) CRISPR 編輯需要的試劑

如需板形式或其他特殊訂購形式的向?qū)?/span> RNAs，請(qǐng)聯(lián)系我們

適用于 CRISPR 的 TrueGuide 合成 gRNA

Invitrogen TrueGuide 合成 gRNAs 是一種即用型轉(zhuǎn)染 CRISPR 向?qū)?RNAs，采用專有算法設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)高效編輯。這些預(yù)設(shè)計(jì)的、可靠的單向?qū)?RNAs 可提供靶向敲除，在人和小鼠基因組有高特異性。

數(shù)據(jù)：使用 TrueGuide 合成 gRNAs 進(jìn)行高效編輯

圖 1.在表達(dá) Cas9 的 ME-180 細(xì)胞中使用 TrueGuide 合成 gRNAs 穩(wěn)健切割激酶基因。平均切割效率為> 60%。

數(shù)據(jù)：TrueGuide 合成 gRNAs 有助于維持細(xì)胞活力

圖 2.TrueGuide 合成 gRNAs 與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案一起使用，可降低細(xì)胞毒性。使用我們推薦轉(zhuǎn)染方案，采用 Lipofectamine CRISPRMAX 形成復(fù)合物，并將 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和靶向特異性 TrueGuide 合成 gRNA 遞送至兩種癌細(xì)胞系中。在這 3 個(gè)基因位點(diǎn)中，已知有 2 個(gè)（PRKCG-T1 和 CMPK1-T1）難以編輯。使用 PrestoBlue 檢測(cè)細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的毒性極低，總體細(xì)胞活力保持在接近 100% 的水平。

TrueGuide 合成向?qū)?RNAs — 常見問題 (FAQs)

Q：什么是 gRNA？

A：gRNA （或稱向?qū)?RNA）是 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的一部分。gRNA 分子有兩個(gè)組分：一個(gè)靶點(diǎn)特異性 CRISPR RNA (crRNA) 和一個(gè)輔助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通過 20-mer crRNA 序列與靶基因組序列之間的堿基配對(duì)，將 Cas9 蛋白導(dǎo)入特異性基因位點(diǎn)。

Q：什么是 sgRNA？是否提供兩部分合成 gRNA？

A：sgRNA 代表單向?qū)?RNA，與傳統(tǒng)的天然化膿性鏈球菌 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)不同，其使用兩部分向?qū)В渲?CRISPR RNA (crRNA) 與 tracrRNA 雜交。sgRNA 將兩個(gè) RNA 結(jié)合成單個(gè)長(zhǎng) RNA。sgRNA 的長(zhǎng)度通常為 100 nt，可以從載體表達(dá)或化學(xué)合成。

由于與雙部分 gRNA相比，修飾的 sgRNA 在更多類型的細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的效率，因此 TrueGuide crRNA:tracrRNA 兩部分向?qū)?RNA 產(chǎn)品形式已停用。這使得我們能夠簡(jiǎn)化我們的合成 gRNA 產(chǎn)品，并專注于修飾的 sgRNA。

Q：有哪些 gRNA 形式可供選擇？

A：CRISPR gRNA 可以從賽默飛世爾科技獲得，有以下兩種形式可供選擇：化學(xué)合成的 RNA 寡核苷酸、包裝的慢病毒顆粒或使用 GeneArt 精確 gRNA 合成試劑盒生成的體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) gRNA。

Q：TrueGuide 合成 gRNA 是否經(jīng)過化學(xué)修飾？能獲得未經(jīng)修飾的版本嗎？

A：化學(xué)修飾包括分子 5' 和 3' 末端的 2' O-甲基類似物和硫代磷酸酯核苷酸間鍵。這些修飾分別通過增強(qiáng)與靶位點(diǎn)的結(jié)合并抑制核酸酶降解提高編輯效率。

您可以使用定制 gRNA 訂購工具購買未進(jìn)行任何化學(xué)修飾的 sgRNA。

Q：為什么要使用 TrueGuide 合成 gRNA 而不是質(zhì)粒表達(dá) gRNA？

A：用 TrueCut Cas9 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染時(shí)，TrueGuide 合成 gRNA 在廣泛的細(xì)胞類型中有更高的編輯效率，同時(shí)降低了細(xì)胞毒性和先天性免疫反應(yīng)。與質(zhì)粒系統(tǒng)不同，RNP 系統(tǒng)是瞬時(shí)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化較快，可降低隨機(jī)整合和脫靶效應(yīng)。

Q：TrueGuide 合成 gRNA 如何進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)？

A：采用質(zhì)譜法分析 TrueGuide 合成 gRNA 序列，以驗(yàn)證序列完整性。

Q：哪種方法是檢測(cè)切割效率的最佳方法？

A：為了估計(jì)混合細(xì)胞群中 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的編輯效率，您可以使用 GeneArt 基因組切割檢測(cè)試劑盒、新一代測(cè)序 (NGS) 或 Sanger 測(cè)序。無論是對(duì)編輯群中擴(kuò)增子的 NGS 測(cè)序還是對(duì)克隆到質(zhì)粒中的擴(kuò)增子的 Sanger 測(cè)序，均可更準(zhǔn)確地估計(jì)編輯效率和插入缺失類型的百分比。這些方法的更廣泛的討論請(qǐng)參閱 TALEN 和 CRISPR 驗(yàn)證工具頁面，實(shí)驗(yàn)方案指導(dǎo)請(qǐng)參閱 TrueGuide 合成 gRNA 用戶指南。

適用于篩選和編輯難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的LentiArray 慢病毒 gRNA

Invitrogen LentiArray CRISPR gRNA 是經(jīng)過預(yù)設(shè)計(jì)的預(yù)包裝 gRNA 慢病毒，專門用于高效基因敲除。LentiArray CRISPR gRNA 設(shè)計(jì)使用專有 gRNA 設(shè)計(jì)算法創(chuàng)建，且經(jīng)過優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)高效基因敲除，同時(shí)不會(huì)影響特異性。  

使用 LentiArray CRISPR 文庫進(jìn)行高通量篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以使用 LentiArray CRISPR gRNA 支持篩選前檢測(cè)方法開發(fā)和篩選后結(jié)果驗(yàn)證。應(yīng)將 LentiArray CRISPR gRNA 與 LentiArray Cas9 慢病毒結(jié)合使用，以進(jìn)行難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和原代細(xì)胞的基因組編輯實(shí)驗(yàn)。

數(shù)據(jù)：使用 LentiArray gRNA 成功敲除 EGFP

圖 3.使用 LentiArray gRNA 進(jìn)行 CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的 EGFP 敲除。(A) 用 LentiArray Cas9 慢病毒和 LentiArray CRISPR gRNA 對(duì) A431 細(xì)胞進(jìn)行 EGFR 敲除（右列），并與未經(jīng)處理細(xì)胞（野生型，左列）和用 Cas9 處理但未經(jīng) gRNA 處理的細(xì)胞（Cas9 對(duì)照，中間列）進(jìn)行對(duì)比。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 EGFR 表達(dá)（綠色）、細(xì)胞核（藍(lán)色）和細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白 Actin（紅色）染色，并進(jìn)行免疫熒光分析。僅在 EGFR 敲除細(xì)胞（c、f）中觀察到 EGFR 表達(dá)缺失。(B) 還通過免疫印跡觀察到 EGFR 敲除細(xì)胞的 EGFR 信號(hào)相對(duì)于對(duì)照減少。

適用于快速生成定制設(shè)計(jì)的 IVT gRNA

GeneArt 精確 gRNA 合成試劑盒是快速合成向?qū)?RNA (gRNA) 的完整系統(tǒng)。  

使用該試劑盒，以兩個(gè)編碼靶序列的短單鏈寡核苷酸為起始材料，將這些寡核苷酸和 T7 啟動(dòng)子進(jìn)行一次較短的“一鍋"PCR 反應(yīng)，組裝生成 gRNA 模板。隨后，組裝產(chǎn)物用作體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 反應(yīng)的模板。后續(xù)快速純化步驟會(huì)在短短 4 小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生高產(chǎn)量 (>10 μg)、高濃度 (>200 ng/μL)和可直接轉(zhuǎn)染的 gRNA。

IVT gRNA 與我們的 TrueCut Cas9 蛋白 v2 已經(jīng)在多種懸浮和貼壁細(xì)胞系中進(jìn)行測(cè)試，具有 >70% 的切割效率且無毒性跡象。  

所得 gRNA 也可以與我們的即用型轉(zhuǎn)染 CRISPR 核酸酶 mRNA 進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。蛋白質(zhì)和 mRNA Cas9 兩種形式均無需進(jìn)行質(zhì)粒操作，并且與高通量和多重全基因組細(xì)胞工程方法相容。

賽默飛提供適用于 CRISPR-Cas9 和篩選應(yīng)用的高質(zhì)量 gRNAs產(chǎn)品，請(qǐng)復(fù)訪問了解更多產(chǎn)品信息。