植物內(nèi)生菌宏基因組研究
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- 更新時(shí)間 2025/4/17 16:53:57
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植物內(nèi)生菌中可培養(yǎng)的微生物種類十分有限,宏基因組學(xué)(metagenomics)是研究植物內(nèi)生菌的有效手段之一。植物內(nèi)生菌宏基因組研究通過(guò)不依賴于純培養(yǎng)的宏基因組學(xué)(metagenomics)研究方法,構(gòu)建植物內(nèi)生菌的宏基因組文庫(kù),并從該文庫(kù)中直接篩選獲得生物合成基因簇,進(jìn)一步鑒定其功能, 對(duì)植物內(nèi)生菌進(jìn)行定性及定量分析，為植物的微生物起源提供直接的證據(jù)。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
? 超深度檢測(cè)：提取的全宏基因組DNA建立隨機(jī)小片段文庫(kù)，避免了目的片段的PCR過(guò)程，降低bias，隨機(jī)測(cè)序，獲取更豐富的序列信息。
? 植物組織表面菌處理：通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法去除植物外表面菌株污染，準(zhǔn)確測(cè)序植物內(nèi)生菌種類、豐富及互作關(guān)系，真實(shí)還原構(gòu)建微生態(tài)系統(tǒng)的功能網(wǎng)絡(luò)。
? 16S全長(zhǎng)檢測(cè)：植物內(nèi)生菌提取DNA后，通過(guò)16S全長(zhǎng)擴(kuò)增，質(zhì)控內(nèi)生菌提取效果。
研究方向：
植物內(nèi)生菌宏基因組學(xué)研究為植物微生物起源、植物的營(yíng)養(yǎng)和抗病育種提供內(nèi)生菌角度的新策略。
技術(shù)路線：
DNA樣品→文庫(kù)構(gòu)建→上機(jī)測(cè)序→數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)策略：
外源菌去除→內(nèi)生菌DNA提取→16S全長(zhǎng)質(zhì)控→建庫(kù)質(zhì)控→上機(jī)測(cè)序
分析內(nèi)容：
植物內(nèi)生菌宏基因組測(cè)序分析內(nèi)容 | |
標(biāo)準(zhǔn)分析 | 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和統(tǒng)計(jì) 1、測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 2、原始測(cè)序數(shù)據(jù)格式介紹（Rawdata） 3、原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估（MultiQC） 4、原始數(shù)據(jù)過(guò)濾和數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì) |
去除宿主序列 | |
單樣本組裝 | |
ORFs 預(yù)測(cè) 1、生成 gene catalogue 以及其豐度表計(jì)算 2、基因集 Pan-Core 飽和曲線分析 | |
群落結(jié)構(gòu)分析 1、 物種注釋 1) 物種豐度表 2) 整體物種組成 3) 物種分布統(tǒng)計(jì) 2、多樣性分析 1) Alpha 多樣性分析 2) Beta 多樣性分析 3、物種組成差異分析 1) 基于物種豐度的降維分析 2) 物種豐度聚類分析 3) 物種豐度的 Venn 圖和花瓣圖分析 4) 組間差異物種的 Metastat 分析 5) LEfSe 分析解析差異 biomarker 6) 組間差異 STAMP 分析 7) 物種驅(qū)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)分析 8) 組內(nèi)核心物種分析 | |
群落功能分析 1、基因功能注釋 1) Microorganism 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 2) COG/NOG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 3) KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 4) CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 5) SignalP 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 6) TMHMM 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 7) 耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù) CARD 注釋 8) 重金屬抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù) BacMet 注釋 9) 氮循環(huán)數(shù)據(jù)庫(kù) NCycDB 注釋 10) 可移動(dòng)遺傳原件 MGEs 注釋 11) 16SrRNA 注釋 12) 細(xì)菌毒力因子 VFDB 注釋 13) 原生生物數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 14) 構(gòu)建 gene catalogue 注釋百科全書
2、功能多樣性分析 1) Alpha 多樣性分析 2) Beta 多樣性分析 3) 功能差異分析 4) KEGG 功能差異 5) COG 功能差異 6) CAZy 功能差異 7) CARD 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋差異分析 8) BacMet 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋差異分析 9) NCycDB 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋差異分析 10) MGEs 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋差異分析 11) Protists 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋差異分析 | |
多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析 1、環(huán)境數(shù)據(jù)差異性檢驗(yàn) 2、相關(guān)性關(guān)聯(lián)分析 | |
分箱分析(Bining) 1、Contigs 分箱 2、目標(biāo) Bins 分析 | |
注：個(gè)性化分析、多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析請(qǐng)聯(lián)系對(duì)接銷售或技術(shù)支持 | |
送樣要求：
植物內(nèi)生菌送樣要求 | 項(xiàng)目周期 |
? 植物內(nèi)生菌樣本 1) 根據(jù)植株大小及研究目的確定取樣范圍，采集植物組織后置于無(wú)菌取樣袋或50mL離心管中暫時(shí)保存，建議每個(gè)樣采集25g以上，保證分裝后每份約10~15g鮮重； 2) 6小時(shí)內(nèi)可用冰袋運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，超過(guò)6小時(shí)建議液氮或干冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，常溫需在2小時(shí)內(nèi)完成采集和運(yùn)輸； ? 測(cè)序策略：PE150 ? 其他注意事項(xiàng)： ① 最終樣本質(zhì)量以我司的檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)； ② 若樣本總量超過(guò)要求，可以進(jìn)行樣本保存，反樣；項(xiàng)目完成后，將不再保存剩余樣品。 | 20個(gè)樣本以下標(biāo)準(zhǔn)流程的運(yùn)轉(zhuǎn)周期約為36個(gè)工作日。遇到樣本數(shù)目較多時(shí)，項(xiàng)目周期需要與技術(shù)支持人員確定。 |
經(jīng)典案例
病原菌介導(dǎo)植物內(nèi)生菌群抑病功能的激活
Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.
1、背景
植物微生物組研究已經(jīng)積累了大量的測(cè)序數(shù)據(jù)和豐富的信息，表明了許多植物根際、葉際、種子和胚層中不同微生物群落的多樣性和豐富度。然而迄今為止，很少有研究論證微生物組對(duì)特定植物表型（即植物生長(zhǎng)、發(fā)育和健康）的功能影響。因此，在分子和化學(xué)層面上許多植物表型與微生物組結(jié)構(gòu)和功能之間在的因果關(guān)系仍然未知。本研究旨在探討植物內(nèi)生微生物菌群（植物內(nèi)生菌）的基因多樣性及對(duì)真菌感染植株的保護(hù)作用。
2、方法
為了解生活在植物根組織中的植物內(nèi)生菌的抑病功能，作者對(duì)生長(zhǎng)在抑病土壤中的甜菜幼苗根內(nèi)進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析；并鑒定與抑病相關(guān)的微生物群落和功能組成，以區(qū)分哪些生物合成基因簇（BGCs）在感染過(guò)程中上調(diào)，然后重組內(nèi)生菌群；最后進(jìn)行位點(diǎn)定向突變，檢測(cè)特異性BGCs是否在抑病過(guò)程中起著重要作用。
作者設(shè)置甜菜種植在感病(Conducive, C)和抑病 (Suppressive, S) 土壤和是否接種病原菌R. solani（R）共計(jì)四個(gè)處理（C,C+R,S,S+R）。在抑病土壤中接種病原菌(S+R)的甜菜發(fā)病率為15-30%，在感病土壤中接種病原菌(C+R)的甜菜發(fā)病率為80%。
研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖
植物內(nèi)生菌宏基因組測(cè)序分析流程
3、結(jié)論
本研究中，植物內(nèi)生菌的宏基因組學(xué)研究和網(wǎng)絡(luò)推論表明，植物根部的真菌感染在根內(nèi)Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae富集；同時(shí)，幾丁質(zhì)酶基因、編碼非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）和聚酮合成酶（polyketide synthases，PKSs）產(chǎn)生的各種未知生物合成基因簇。在菌株基因組重建后，由Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae合成的菌群持續(xù)抑制真菌根部疾病。定點(diǎn)誘變表明，黃桿菌中此前未鑒定的NRPS-PKS基因簇對(duì)內(nèi)生菌群抑病至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，內(nèi)生根微生物組（植物內(nèi)生菌）具有許多尚不為人所知的功能性狀，可以共同保護(hù)植物內(nèi)外。
圖：內(nèi)生菌群落生物合成基因簇的多樣性和分布
參考文獻(xiàn)：
① Carrión VJ,et al.Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science. 2019 Nov 1;366(6465):606-612.
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