N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）是一種普遍存在于真核生物tRNA、rRNA和mRNA且可逆的轉(zhuǎn)錄后RNA修飾?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)研究揭示m1A RNA修飾在基因調(diào)控和生物過(guò)程中的關(guān)鍵作用：對(duì)RNA穩(wěn)定性和翻譯起始等過(guò)程有著重要調(diào)節(jié)作用，廣泛參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。

m1A RNA修飾的檢測(cè)，易基因采用基于抗體富集的甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序方法（MeRIP-seq/m1A-seq），該技術(shù)利用m1A特異性抗體富集發(fā)生m1A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，對(duì)RNA上的m1A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，僅需1μg總RNA。

易基因提供適用于不同科研需求的m1A-seq技術(shù)：

?  m1A甲基化-常量mRNA 甲基化測(cè)序（m1A-seq）

?  m1A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（lnc-m1A-seq）

?  m1A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（Micro-lnc-m1A-seq）

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

?  起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，僅需1μg總RNA；

?  轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA；

?  樣本要求：可用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m1A檢測(cè)；

?  重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，降低抗體富集偏差

?  應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域。

技術(shù)路線：

RNA樣品→文庫(kù)構(gòu)建→上機(jī)測(cè)序→數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)策略：

材料選取 → RNA提取→RNA片段化→抗體富集→反轉(zhuǎn)錄得cDNA文庫(kù)→接頭連接

→PCR擴(kuò)增→文庫(kù)制備→上機(jī)測(cè)序

圖：微量MeRIP-seq實(shí)驗(yàn)流程

分析內(nèi)容：

送樣要求：

典型案例

真核生物mRNA中的m1A甲基化動(dòng)態(tài)變化研究

The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA

背景

m1A RNA甲基化發(fā)生在Watson-Crick區(qū)域，可能影響RNA堿基配對(duì)，還促進(jìn)腺苷修飾在生理?xiàng)l件下帶正電荷，可能會(huì)顯著改變RNA結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)-RNA互作。

方法

研究人員對(duì)人HeLa（宮頸腺癌），HepG2（肝細(xì)胞癌）和HEK293（胚胎腎）細(xì)胞系（ATCC）和原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）（C57BL / 6，ATCC）進(jìn)行基于抗體富集的RNA甲基化免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq，m1A-seq），在轉(zhuǎn)錄組范圍定位m1A位點(diǎn)，并將其與Dimroth重排反應(yīng)進(jìn)行耦聯(lián)以獲得高分辨率m1A圖譜。

結(jié)果

m1A-seq結(jié)果表明m1A在剪接位點(diǎn)上游起始密碼子周圍富集：m1A傾向于修飾翻譯起始位點(diǎn)周圍一些更結(jié)構(gòu)化的區(qū)域，可以對(duì)生理?xiàng)l件做出動(dòng)態(tài)響應(yīng)，并與蛋白質(zhì)生成呈正相關(guān)。這些特異性特征在小鼠與人類細(xì)胞中高度保守，證明了m1A在促進(jìn)mRNA甲基化翻譯中發(fā)揮作用。

圖：m1A-seq表明m1A與人轉(zhuǎn)錄組中的翻譯起始位點(diǎn)（TIS）相關(guān)

參考文獻(xiàn)：

①     Dominissini D, et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 2016 Feb 25;530(7591):441-6. pii: nature16998.