漆酶（Laccase）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/48S

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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，廣泛分布于真菌和高等植物中，具有較強(qiáng)的氧化還原能力，在紙漿生物漂白，環(huán)境污染物降解和木質(zhì)纖維素降解以及生物檢測(cè)方面有非常廣泛的應(yīng)用。

測(cè)定原理：

漆酶分解底物ABTS 產(chǎn)生ABTS 自由基，在 420nm 處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS，測(cè)定 ABTS 自由基的增加速率，可計(jì)算得漆酶活性。

試劑組成和配制：

工作液：粉劑×1 瓶，4℃避光保存，臨用前加 15ml 試劑一溶解；用不完的試劑 4℃保存一周。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 30min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、細(xì)胞培養(yǎng)液：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

60℃水浴 20min 后冷卻至室溫，取 200μl 反應(yīng)液于微量石英比色皿/96 孔板中測(cè)定 420nm 處吸光值A(chǔ)，

△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。

注意事項(xiàng)

1、極少數(shù)樣本在 60℃水浴 20min 后會(huì)出現(xiàn)沉淀，可經(jīng)過(guò) 8000g 25℃離心 10min 后，取上清檢測(cè)，例如成熟的水稻葉片樣本。

2、為確保檢測(cè)準(zhǔn)確性，若ΔA 大于 1，將樣本用提取液稀釋 2~10 倍后重新檢測(cè)，計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

酶活性計(jì)算公式：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 9.26×△A÷Cpr

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 9.26×△A÷W

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /104 cell）= 4．按照液體體積計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T= 9.26×△A÷細(xì)胞數(shù)量

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

 漆酶活性（nmol/min /L）=d ×V 反總÷V 樣÷T= 9260×△A

ε：ABTS 毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，0.3ml；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.03ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 18.52×△A÷Cpr

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 18.52×△A÷W

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /104 cell）=

= 18.52×△A÷細(xì)胞數(shù)量 4．按照液體體積計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 底物ABTS 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

?A

漆酶活性（nmol/min /L）=

?? d ×V 反總÷V 樣÷T= 18520×△A

ε：ABTS 毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，0.3ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.045ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min。

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