環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑篩選試劑盒(Cyclooxygenase 2 Inhibitor Screening Kit，也稱COX-2 Inhibitor Screening Kit)是一種利用熒光檢測，簡單、快速、靈敏地用于人COX-2抑制劑高通量篩選的試劑盒。
      環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, COX)又稱前列腺素內(nèi)氧化酶合成酶(Prostaglandin-endoperoxide synthase, PTGS)，是一種同時具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性的雙功能酶。例如，COX的環(huán)氧化酶活性可以催化花生四烯(Arachidonic Acid, AA)轉(zhuǎn)化為前列腺素G2(prostaglandin G2, PGG2)，而COX的過氧化氫酶活性又可以將前列腺素G2轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(prostaglandin H2,
PGH2)。
      有兩種常見的COX，一種是組成性表達的COX-1，另一種是誘導(dǎo)性表達的COX-2。哺乳動物的COX-1與COX-2的分子量相似，分別是70和72KDa，其氨基酸序列有65%同源，其中酶催化活性區(qū)域的氨基酸序列幾乎*。COX-1在很多組織中組成性表達，在胃粘膜、腎臟等中高表達，催化產(chǎn)生維持正常生理功能的前列腺素，從而參與血管舒縮、血小板聚集、胃粘膜血流、胃黏液分泌及腎臟功能等的調(diào)節(jié)。COX-2在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達或表達很少，僅在腦、腎臟和生殖器官等中有一定水平的組成性表達。COX-2在巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和單核細胞等發(fā)生炎癥反應(yīng)時，可以被誘導(dǎo)表達。例如受炎性刺激物、損傷、有絲分裂原或致癌物質(zhì)等促炎介質(zhì)誘導(dǎo)后，COX-2的表達增高，從而參與多種病理生理過程。COX-3是COX-1的不同剪接體，和COX-1相比，COX-3多保留了一個內(nèi)含子，在狗(dog)中該內(nèi)含子的長度為93個堿基，而在人和小鼠中長度為94個堿基，因此在狗中COX-3是有酶活性的，而人和小鼠中的COX-3由于移碼突變而沒有酶活性。
      環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑篩選試劑盒COX-2與炎癥和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，COX-2的選擇性抑制劑成為藥物研究的一個熱點。1991年1月*個真正意義上的COX-2選擇性抑制劑塞來昔布(Celecoxib)經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市，同年5月第二個選擇性抑制劑羅非昔布(Rofecoxib)也在歐洲上市。這些COX-2抑制劑藥物成功上市，為后續(xù)COX-2選擇性抑制劑的研究和發(fā)展開辟了廣闊道路。如今在臨床上COX-2選擇性抑制劑已經(jīng)被廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牙痛、手術(shù)后疼痛以及腫瘤等疾病。
      本試劑盒的檢測的基本原理參考圖1。在輔助因子(Cofactor)存在的情況下，COX-2使用其環(huán)氧化酶(COX)活性把花生四烯酸(Arachidonic Acid)等底物環(huán)氧化生成PGG2等中間產(chǎn)物，繼而COX-2使用其過氧化物酶(peroxidase)活性把PGG2等中間產(chǎn)物催化生成PGH2等zui終產(chǎn)物，同時把幾乎沒有熒光的COX-2探針(Probe)催化生成有強熒光的探針(Ex560/Em590)。這樣通過熒光檢測就可以非常靈敏地檢測COX-2的酶活性。如果在反應(yīng)中加入COX-2抑制劑(Inhibitor)，熒光的生成就會被抑制，熒光強度與抑制劑的抑制效果成反比，這樣就可以檢測出抑制劑的抑制效果。本反應(yīng)生成的強熒光探針的zui大激發(fā)波長為571nm，zui大發(fā)射波長為585nm，推薦檢測時的激發(fā)波長為560nm ，發(fā)射波長為590nm。

圖1. 本試劑盒篩選COX-2抑制劑的原理圖。Probe*表示催化生成的強熒光探針。
      環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑篩選試劑盒中提供了人重組COX-2(recombinant human COX-2, rhCOX-2)、底物(Substrate)、輔助因子(Cofactor)、陽性對照COX-2抑制劑(Celecoxib)及可以被COX-2催化產(chǎn)生熒光的熒光探針(Probe)，并且對COX-2和底物的使用量進行了優(yōu)化。不僅能檢測出IC50很低的抑制劑，也能檢測出IC50較高的抑制劑。
      用于96孔板檢測時，一個包裝的本試劑盒可以進行100次檢測。
包裝清單：
產(chǎn)品編號    產(chǎn)品名稱    包裝
S0168-1    COX-2 Assay Buffer    30ml
S0168-2    COX-2 Probe    600μl
S0168-3    COX-2 Cofactor (50X)    20μl
S0168-4    COX-2 Substrate (50X)    20μl
S0168-5    Substrate Buffer    100μl
S0168-6    rhCOX-2 (25X)    22μl
S0168-7    Celecoxib (100μM)    20μl
—    說明書    1份
保存條件：
      -20℃保存，半年有效。S0168-2 COX-2 Probe和S0168-3 COX-2 Cofactor (50X)需避光保存。
注意事項：
      COX-2 Probe在空氣中不太穩(wěn)定，開啟后應(yīng)盡快使用，且在使用過程中要注意適當(dāng)避光。
      COX-2 Probe的反應(yīng)產(chǎn)物在還原劑的存在下會很不穩(wěn)定，樣品中帶入到zui終反應(yīng)體系中的二硫蘇糖醇(DTT)或者β-巰基乙醇的濃度須低于10μM。
      請確保樣品的pH值在7-8之間，或者確保加入樣品后反應(yīng)體系的pH值在7-8之間，否則會影響COX-2 Probe的穩(wěn)定性和熒光值。
      COX-2 Probe和COX-2 Assay Buffer需要*解凍并回復(fù)至室溫后再使用，否則會影響檢測結(jié)果。rhCOX-2使用時應(yīng)在冰上進行。使用完畢后各試劑應(yīng)立即按照試劑盒要求的條件保存。
      COX-2 Substrate容易被氧化，請盡量避免長時間與空氣接觸。且在使用和儲存過程中請注意保持低溫，否則其穩(wěn)定性可能會受到影響。
      待測抑制劑的溶劑可能會對檢測產(chǎn)生干擾，如無水乙醇和70%乙醇。推薦以COX-2 Assay Buffer、Milli-Q級純水、DMSO為溶劑配制、稀釋待測抑制劑，并在對照孔中添加與抑制劑等體積的溶劑以排除干擾。
      COX-2 Cofactor、COX-2 Substrate、rhCOX-2等試劑的量均比較少，在使用前請先適當(dāng)離心，然后適當(dāng)混勻后再使用。
      Substrate Buffer有腐蝕性，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或腐蝕其他物品；Celecoxib對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
      環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑篩選試劑盒僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。