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德國拜發(fā)甘油檢測試劑盒

甘油檢測試劑盒

（酶學(xué)試劑盒）

酶法分析試劑盒（紫外分光光度法）

RIDASCREEN（產(chǎn)品編號：0 414 433）      30次檢測

1. 簡介

酶法分析試劑盒（紫外分光光度法）此法適用于檢測食品（啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒）、化妝品、藥品（溶液、栓劑）、紙板、煙草及生物制品中的甘油。

2.  原理

甘油在甘油激酶的催化下可被ATP磷酸化為3-磷酸甘油酯，ATP轉(zhuǎn)化為ADP； 反應(yīng)式為

                GK

Glycerol﹢ATP           L-glycerol-3-phosphate﹢ADP

上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可與PEP作用下生成ATP及丙酮酸酯； 反應(yīng)式為

           PK

ADP﹢PEP          ATP﹢Pyruvate

丙酮酸酯在L-乳酸酯脫氫酶的作用下可被NADH還原為L-乳酸酯，NADH被氧化為NAD； 反應(yīng)式為

                  L-LDH

Pyruvate﹢NADH﹢H﹢       L-lactate﹢NAD﹢

被氧化的NADH的量取決于甘油的量，NADH的吸光度值可在334，340及365nm下測量。

3.  試劑盒內(nèi)容物

----瓶1共有3瓶，每瓶約有2g輔酶及緩沖液的混和物，包括：甘氨酰甘氨酸緩沖液， PH約7.4； NADH約7mg；ATP約22mg；PEP-CHA約11mg；硫酸鎂

----瓶2約0.4ml懸浮物，包括：

丙酮酸激酶，約240U； L-乳酸酯脫氫酶，約220U

----瓶3約0.4ml甘油激酶懸浮物，約34U

----瓶4為甘油檢測對照溶液（甘油檢測對照溶液可不需要計算結(jié)果），此溶液使用時不需稀釋。（效期見標(biāo)簽）

4.  檢測溶液的制備 （10次）

----取出1瓶瓶1， 用11ml重蒸水溶解，使用時此溶液需在20-25℃持續(xù)回溫約10分鐘

----瓶 2不需稀釋

----瓶 3不需稀釋

5.  操作者應(yīng)該注意之事項

使用前請仔細(xì)閱讀，中文翻譯件僅供參考

----瓶1約含500mg碳酸鈉，應(yīng)避免接觸皮膚和呼吸器官，其他用于甘油檢測的試劑不具有危險性

----實驗之后，用過的試劑可作為實驗室廢料處理，但必須在當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)允許的前提下

6.  儲存條件

----瓶 1在2-8℃下保存（見標(biāo)簽），溶液1在2-8℃下可保存4天，溶液1使用前需回溫至20-25℃

----瓶2及3在2-8℃下保存（見標(biāo)簽）

7.  樣品處理

----直接取用無色，透明，中性的溶液或按稀釋表格稀釋后進行檢測，體積為2.000ml

----過濾混濁溶液

----除去樣品溶液中的二氧化碳?xì)怏w

----加入氫氧化鈉或氫氧化鉀來調(diào)節(jié)酸溶液的PH值約為8

----對于深顏色的樣品溶液可不需稀釋或者用PVPP或酰胺配成較高濃度的溶液如：1g/100ml

----粉碎或均質(zhì)固體和半固體樣品，用水抽提或溶解，而后過濾，通過Carrez澄清液可脫去其中的混濁物或色素

----用Carrez試劑可脫去樣品中的蛋白質(zhì)

----用熱水抽提樣品中的脂肪（抽提溫度需在脂肪的溶解度之上），冷卻后可分離出脂肪，將余下物質(zhì)轉(zhuǎn)移至容量瓶中并加水至刻度，冰浴15分鐘而后過濾，熱水抽提后用Carrez溶液澄清

8.  過程

1.  波長：340nm，Hg365nm或Hg334nm

2.  比色杯：光徑1.0cm

3.  溫度：20-25℃

4.  zui終體積：3.020ml

5.  對照空氣（光路上無比色杯）或?qū)φ账x取讀數(shù)

6.  樣品溶液：1-40ug甘油/檢測（體積為0.100-2.000ml樣品體積）

7. 具體操作見如下表格

分別測樣品與空白的吸光度值差，而后用樣品吸光度值差減去空白吸光度值差可以得到如下公式

△A=（A1 ―A2）Sample―（A1 ―A2）blank

若想得到一個足夠精確的結(jié)果，則測得的吸光度的單位至少為0.100單位。

如果吸光度值差△A在334及340nm下測得的值高于1.000或在365nm下測得的值高于0.500，如此則表明樣品溶液中甘油的濃度較高。

需根據(jù)稀釋表格進行樣品的稀釋

9.  計算

根據(jù)以下公式計算濃度

V×MW

C=-----------------------×△A（g/l）

ε×d×v×1000

V=zui終體積（ml）

V=樣品體積（ml）

MW=被檢測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量

D=光徑（cm）

ε=NADH的消光系數(shù)

340nm=6.3（1×mmol-1×cm-1）

Hg365nm=3.4（1×mmol-1×cm-1）

Hg334nm=6.18（1×mmol-1×cm-1）

甘油含量計算遵循如下公式

3.020×92.1

C=----------------------------×△A

ε×1.00×0.100×1000

2.781

=----------------×△A（g甘油/l樣品溶液）

ε

如果樣品溶液是稀釋使用的，在計算結(jié)果時需乘以稀釋系數(shù)F。

當(dāng)分析固體或半固體時，測量前需稱一定重量配制樣品溶液，其結(jié)果需按下式計算

C 甘油（g/l樣品溶液）

C甘油 =--------------------------×100（g/100g）

W 甘油（在樣品溶液中）

10. 檢測操作說明

被檢樣品中甘油含量在1ug至40ug之間。

為了得到一個足夠的吸光度值差，樣品溶液的濃度稀釋在0.04g/L至0.4g/L之間。

稀釋表格

如果測得的吸光度值△A較低，例如低于0.100，則樣品溶液需重新配制，可由下列幾種解決方法

1. 可多稱出些樣品或不要過分稀釋。

2. 加入到比色杯中的溶液體積可增加至2.000ml，當(dāng)然為了得到相同的zui終體積（樣品和空白），加入的水的體積就要相應(yīng)減少。所加入的新溶液的體積在計算時是要考慮進去的。

11. 技術(shù)信息

加入懸浮物2（PK/L-LDH）后等待前反應(yīng)進行*后是非常必要的。

12. 特性

此法特異性適于甘油的檢測。

13. 靈敏度和檢測限

1. zui小的吸光分辨率為0.005個吸光單位，相應(yīng)的zui大樣品體積為2.000ml，340nm下測量，則樣品的甘油濃度為0.1mg/L；若樣品體積為0.100ml，則樣品的甘油濃度為2mg/L。

2. 340nm下，吸光度值差為0.020可導(dǎo)出檢測限為0.4mg/L，相應(yīng)的zui大體積為2.000ml。

14. 線性

從1ug甘油/檢品（0.4mg甘油 /L樣品溶液，樣品溶液V=2.000ml）到40ug甘油/檢品（0.4g甘油/L樣品溶液，樣品V=0.100ml）

15. 精確性

用同一樣品溶液做平行測定時，其吸光度值差會有0.005至0.010的差異，樣品體積為0.100ml，340nm下測量，相應(yīng)的甘油濃度約為2-5mg/L；若樣品是經(jīng)過稀釋的，則在計算結(jié)果時需乘以稀釋倍數(shù)。

16. 干擾信息來源

ATP和PEP的緩慢水解同NADH的緩慢氧化均可導(dǎo)致緩慢的蠕變反應(yīng)；空白和樣品的吸光度值可不必逐一立即檢測。

17. 檢測過程中的干擾

1. 根據(jù)過程中所給定的時間甘油若能轉(zhuǎn)化*，則可斷定沒有干擾發(fā)生。

2. 反應(yīng)結(jié)束后，可加入一些甘油重新檢測（定性或定量）：如果加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，吸光度值會隨之改變，則可斷定沒有干擾發(fā)生。

3. 操作過程中的錯誤和干擾可通過兩個樣品體積的平行實驗測得（如0.100ml和0.200ml）：測得的吸光度值差應(yīng)與樣品體積成比例關(guān)系。

當(dāng)測定固體樣品時，可稱取不同質(zhì)量（如1g和2g）于同一100ml容量瓶中，測得的吸光度值差及樣品的質(zhì)量應(yīng)與樣品的體積成比例關(guān)系。

4. 樣品所含物質(zhì)帶來的可能干擾可通過加入內(nèi)標(biāo)來控制：除去樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)的檢測外，樣品加檢測對照溶液也要檢測的，測得的吸光度值差可計算干擾。

5. 通過回收試驗可測定可能的損失：分別測定加入標(biāo)準(zhǔn)與不加入標(biāo)準(zhǔn)的樣品，在誤差范圍之內(nèi)可定量測定附加物。

18.  Carrez試劑的澄清作用

----移取液體樣品于盛有60ml重蒸水的100ml容量瓶中或稱取足夠重量的樣品于100ml容量瓶中

----加入60ml重蒸水

----仔細(xì)加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液（85mM，3.60gK4Fe（CN）6*3H2O/100ml）和5ml Carrez-Ⅱ-溶液（250mM，7.20gZNSO4*7H2O/100ml）

----用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液PH于7.5-8.5，加入每一溶液后需充分混和，加水至容量瓶刻度，混和并過濾

19.  應(yīng)用舉例

1.果汁中甘油的檢測

----稀釋樣品其濃度約在0.4g/L以下（見稀釋表格）

----過濾混濁果汁，取用透明或淡色溶液用于檢測

當(dāng)分析深色果汁時（如：草莓汁和紅葡萄汁）需要先脫色

具體操作

----在10ml果汁中加入0.1g酰胺粉末或PVPP

----攪拌1分鐘后過濾

----取透明溶液用于檢測，該溶液可帶有輕微顏色

2.酒中甘油的檢測

----根據(jù)稀釋表格將樣品進行稀釋

----實際上紅酒不需脫色也可進行檢測

3.啤酒中甘油的檢測

----取5-10ml啤酒用玻璃棒攪拌約1分鐘，除去其中的二氧化碳?xì)怏w

----根據(jù)稀釋表格稀釋脫去二氧化碳?xì)怏w后的樣品

4.煙草制品中甘油的檢測

----充分混合并絞碎樣品

----精確稱取1g樣品于100ml容量瓶中

----加入約70mL水磁力攪拌約1小時20-25℃下，而后加水至刻度，混和并過濾

----移取25ml濾液于50ml容量瓶中

----加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液，5ml Carrez-Ⅱ-溶液及10ml氫氧化鈉溶液，在加入每一溶液后均需充人混和

----加水至刻度混和并過濾，取濾液用于檢（0.100ml-0.500ml）

5.化妝品中甘油的檢測

6.發(fā)酵產(chǎn)品及生物培養(yǎng)基中甘油的檢測

----置樣品（可先經(jīng)過離心）于80℃水浴中15分鐘以停止酶的反應(yīng)

----離心并取上層溶液（可根據(jù)稀釋表格稀釋）用于檢測

----另外可用高氯酸或Carrez溶液脫除蛋白質(zhì)

瓊脂培養(yǎng)基需先均質(zhì)，而后按以上方法進行操作。

德國拜發(fā)甘油檢測試劑盒