利用改進(jìn)的CRISPR/Cas9技術(shù)直接改變細(xì)胞身份

在一項(xiàng)新的研究中，研究人員利用經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9---一種新的革命性的基因編輯技術(shù)---將從小鼠結(jié)締組織中分離出的成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

2006年，日本京都大學(xué)前沿醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所山中伸彌教授發(fā)現(xiàn)如何讓來(lái)自成年結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞返回到未成熟的能夠分化為任何一種細(xì)胞類型的干細(xì)胞。這些所謂的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）因在研究和醫(yī)學(xué)中的巨大潛力僅在6年后就讓山中伸彌教授獲得諾貝爾獎(jiǎng)。

從那之后，科學(xué)家們已發(fā)現(xiàn)其他的方法將一種類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為其他類型的細(xì)胞。這主要是通過導(dǎo)入多種額外拷貝的“主開關(guān)”基因---表達(dá)激活特定細(xì)胞類型所需的整個(gè)基因網(wǎng)路的蛋白---來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

如今，在這項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)杜克大學(xué)的研究人員開發(fā)出一種不再需要導(dǎo)入額外基因拷貝的策略。相反，他們利用一種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9基因編程技術(shù)直接激活已經(jīng)存在于細(xì)胞基因組中的自然拷貝。相關(guān)研究結(jié)果于2016年8月11日在線發(fā)表在Cell Stem Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells”。

這些早期的研究結(jié)果表明相比于*性地將新的基因加入到宿主細(xì)胞基因組中的方法，利用這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9方法實(shí)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接變成神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過程更加*和更加持久。

這些神經(jīng)元細(xì)胞可能能夠被用來(lái)構(gòu)建神經(jīng)疾病模型、發(fā)現(xiàn)新的治療方法和開發(fā)個(gè)人化療法，而且可能在未來(lái)開展細(xì)胞療法。

論文通信作者、杜克大學(xué)生物分子與組織工程中心主任和生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach博士說，“這種技術(shù)在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)上具有很多應(yīng)用。比如，我們可能對(duì)大多數(shù)人的神經(jīng)元如何對(duì)藥物作出反應(yīng)產(chǎn)生一種粗略的印象。獲取你大腦的活組織樣品來(lái)測(cè)試你的神經(jīng)元在倫理上是不允許的。但是如果我們能夠從你的手臂獲得皮膚細(xì)胞，將它轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，然后利用多種藥物組合對(duì)它進(jìn)行處理，我們就可能確定出一種*的個(gè)人化療法。”

論文*作者、Gersbach實(shí)驗(yàn)室研究生Joshua Black說，“面臨的挑戰(zhàn)就是地產(chǎn)生穩(wěn)定的神經(jīng)元，而且它們看起來(lái)非常類似于你體內(nèi)真正的神經(jīng)元。這一直是這個(gè)領(lǐng)域的重大障礙。”

二十世紀(jì)五十年代，英國(guó)發(fā)育生物學(xué)家Conrad Waddington教授提出未成熟的干細(xì)胞分化為特定類型的成體細(xì)胞就好像是從一座有脊的山峰沿著側(cè)邊滾到眾多山谷中的一種。當(dāng)一種細(xì)胞沿著一種特定的斜坡選擇每種路徑后，它對(duì)*目的地的選擇會(huì)變得越來(lái)越少。

你想要改變這種目的地，一種方法就是將這種細(xì)胞垂直地推回到山頂上---這就是將細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的想法。另一種選擇就是水平地讓這種細(xì)胞向上翻越一個(gè)小山峰，直接進(jìn)入另一種山谷。

Gersbach說，“如果你能夠特特異性地激活所有的神經(jīng)元基因，那么就可能不一定需要向上翻越這個(gè)小山峰。”

之前的方法是通過導(dǎo)入攜帶額外基因拷貝---能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量被稱作主轉(zhuǎn)錄因子的蛋白---的病毒來(lái)做到這一點(diǎn)的。這些蛋白（依據(jù)不同的細(xì)胞類型，存在不同）結(jié)合到基因組上的上千個(gè)位點(diǎn)，激活靶細(xì)胞的特定基因網(wǎng)絡(luò)。然而，這種方法也存在一些缺點(diǎn)。

Black說，“不是通過病毒*性地導(dǎo)入現(xiàn)存基因的額外拷貝而是通過提供一種暫時(shí)的信號(hào)以一種穩(wěn)步的方式改變細(xì)胞類型將是可取的。然而，地做到這一點(diǎn)可能需要對(duì)細(xì)胞的基因程序作出非常特異性的改變。”

在這項(xiàng)新的研究中，Black、Gersbach和同事們利用經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9技術(shù)準(zhǔn)確地激活三種基因Brn2、Ascl1和Myt1l來(lái)自然地產(chǎn)生這些控制神經(jīng)元基因網(wǎng)絡(luò)的主轉(zhuǎn)錄因子，而不是導(dǎo)入攜帶這些額外基因拷貝的病毒。

研究人員先將細(xì)菌防御系統(tǒng)CRISPR/Cas9進(jìn)行基因修飾讓它與一種基因激活物偶聯(lián)在一起，這樣仍然能夠鑒定出特異性的DNA片段，但是不會(huì)切割靶片段，而是讓它們保持完整，同時(shí)利用基因激活物將靶片段激活。

在實(shí)驗(yàn)室中，將這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9系統(tǒng)注射到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中。檢測(cè)結(jié)果表明一旦被這種系統(tǒng)激活，這三種神經(jīng)元主轉(zhuǎn)錄因子基因就強(qiáng)力地激活神經(jīng)元基因。這導(dǎo)致這些成纖維細(xì)胞傳導(dǎo)電信號(hào)---神經(jīng)元的一種典型特征。而且即便將與CRISPR/Cas9偶聯(lián)的基因激活物取走后，這些細(xì)胞仍然保持它們的神經(jīng)元性質(zhì)。

Gersbach說，“當(dāng)將攜帶表達(dá)這三種主轉(zhuǎn)錄因子的基因的病毒導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，也可能讓這些細(xì)胞表現(xiàn)得像神經(jīng)元一樣。但是如果它們真地變成自主發(fā)揮功能的神經(jīng)元，那么它們就應(yīng)當(dāng)不需要這種外部的刺激持續(xù)存在。” 

這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的神經(jīng)元在靶基因上的表觀遺傳程序與在小鼠大腦組織中自然發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元標(biāo)志相匹配。

Black解釋道，“利用病毒引入額外基因拷貝的方法大量地產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)錄因子，但是這些基因的自然拷貝非常少地產(chǎn)生這些蛋白。相比之下，這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9方法總體上并不產(chǎn)生如此多的轉(zhuǎn)錄因子，但是它們是由正常的染色質(zhì)位點(diǎn)產(chǎn)生的，這就是這些基因在穩(wěn)步激活后發(fā)生的顯著差別。我們啟動(dòng)這種表觀遺傳開關(guān)來(lái)改變細(xì)胞類型，而不是通過合成方式迫使它們這樣做。”

根據(jù)Black的說法，接下來(lái)的行動(dòng)方案就是將這種方法拓展到人類細(xì)胞中，提高這種技術(shù)的效率，并且試圖清除其他的表觀遺傳障礙，這樣它可能能夠用來(lái)構(gòu)建特定疾病模型。

Gersbach說，“在未來(lái)，你能夠想象在體外制造神經(jīng)元并將它們移植到大腦中來(lái)治療帕金森病或其他神經(jīng)退行性疾病。但是即便我們不能夠走到這一步，我們?nèi)匀荒軌蛟趯?shí)驗(yàn)室中利用這種方法大展手腳來(lái)協(xié)助開發(fā)更好的療法。