單分子成像定位超分辨顯微鏡
當(dāng)前通過(guò)光活化或光開(kāi)關(guān)及位置測(cè)定的超高分辨熒光成像使我們可以理解細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼。在近些年所有超分辨的成像技術(shù)中，定位顯微鏡獨(dú)樹(shù)一幟，因?yàn)樗鼈鬟_(dá)著單分子的分布、距離等信息。在分子水平直接產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)反饋觀察復(fù)雜的生理反應(yīng)，另外有效的染料標(biāo)識(shí)的出現(xiàn)可獲得真實(shí)的分子水平的分辨率，這使得定位顯微鏡更加強(qiáng)大。
定義超分辨技術(shù)
傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡在xy方向的分辨極限是250nm，z軸方向是>450－700nm。這個(gè)極限也被叫做點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)PSF，是一個(gè)點(diǎn)的光通過(guò)顯微鏡被衍射后形成的固定尺寸，它也可以是量度的zui小尺寸的點(diǎn)光源或被顯微鏡可分辨的zui小物體。小于PSF的點(diǎn)被顯微鏡認(rèn)為是與PSF相同的點(diǎn)。物體之間越接近于PSF寬度越不能被單獨(dú)識(shí)別。通常PSF寬度是采用Rayleigh標(biāo)準(zhǔn)：R=0.61λ/NA，NA指數(shù)值孔徑。任何克服了傳統(tǒng)顯微鏡極限至少二者其一的技術(shù)都可被稱(chēng)作超分辨技術(shù)。需要指出的是，當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個(gè)或者更多點(diǎn)光源的時(shí)候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來(lái)進(jìn)行定位．而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個(gè)熒光分子的時(shí)候，通過(guò)特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過(guò)光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級(jí)。
設(shè)備要求
定位顯微鏡搭載起來(lái)很容易，它需要一套寬場(chǎng)顯微鏡，同時(shí)搭載激光光源和激光耦合器，一套靈敏的CCD系統(tǒng)，還有有效的開(kāi)源的軟件算法，像奧林巴斯Olympus可以提供界面友好的集成的這樣一套系統(tǒng)cell^TIRF，可作為多通道的多維的超高分辨單分子定位的檢測(cè)平臺(tái)，它擁有其*的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和相關(guān)的配套系統(tǒng)以保證商業(yè)市場(chǎng)上可獲得的zui高單分子檢測(cè)級(jí)別的同步多色TIRF光學(xué)質(zhì)量。其TIRF物鏡是相關(guān)領(lǐng)域研究大牛的，實(shí)驗(yàn)條件通過(guò)實(shí)驗(yàn)管理界面很容易的控制?？偟膩?lái)說(shuō)奧林巴斯的TIRF主打市場(chǎng)。
算法
定位顯微鏡確實(shí)需要圖像處理的技術(shù)，基于高分辨重建圖像，我們可以用下面開(kāi)源的軟件算法來(lái)進(jìn)行模擬定位的計(jì)算：
- Samuel Hess
- Xiaowei Zhuang
- Ricardo Henriques (QuickPALM plug in Image J)
標(biāo)本準(zhǔn)備
為了得到更好的分辨率的應(yīng)用zui主要依賴(lài)于標(biāo)本的制備，而zui小程度的是依賴(lài)于顯微鏡和算法，每個(gè)用戶(hù)的應(yīng)用需要找到適合自己標(biāo)本的條件，比如：激光強(qiáng)度、照射時(shí)間、區(qū)域和重復(fù)次數(shù)、背景抑制、染料標(biāo)注表達(dá)水平等因素。同時(shí)載物臺(tái)的穩(wěn)定性及Z軸的穩(wěn)定性也是為了獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)而必須考慮的因素。
顯微鏡技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展經(jīng)常給我們帶來(lái)戲劇性的跳躍，生物學(xué)家不再受限于僅僅從總體運(yùn)動(dòng)的可視的分子相互作用上進(jìn)行推理，而是當(dāng)他們劇烈作用時(shí)，可能看到單個(gè)的分子。超高分辨率顯微鏡可以給生物學(xué)家在一個(gè)全新的水平上研究細(xì)胞內(nèi)部的工作狀態(tài)。
