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TRIeasy總RNA提取試劑(TRIeasy Total RNA Extraction Reagent)

TRIeasy^TM Total RNA Extraction Reagent是一種適用于各種動(dòng)植物、細(xì)菌組織、細(xì)胞的總RNA抽提試劑，具有*的裂解能力，可在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)胞和組織樣本，并有效抑制樣本中RNA的降解，保持RNA的完整性。樣品在該試劑中能夠充分裂解，之后加入氯仿離心分層，形成上清層、中間層和有機(jī)層(鮮紅色下層)，RNA分布在上層水相中，收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可得到總RNA。提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質(zhì)及基因組DNA，可直接用于Northern、點(diǎn)雜交、mRNA純化、體外翻譯、RT-PCR、poly(A)+選擇、RNA酶保護(hù)分析以及構(gòu)建cDNA文庫(kù)等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

此外，樣品中的DNA和蛋白也能以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，而在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。

本品操作簡(jiǎn)單快速，所有操作可在一小時(shí)內(nèi)完成。對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的裂解效果。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。4℃避光保存，有效期一年。

注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品中含有苯|酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會(huì)引起中毒、灼傷及其他身體傷害。使用時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物，如防護(hù)|服裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛時(shí)，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

2. 請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作，避免RNase污染。

3. 需自備氯仿、異丙醇（新開(kāi)封或提取RNA專(zhuān)用）、75%乙醇 (DEPC處理水配制)、DEPC和DEPC處理水。

4. 樣品用Total RNA Extraction Reagent勻漿后，如果不加入氯仿進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，可先-70℃凍存，可保存一個(gè)月以上。

5. RNA沉淀在75%乙醇中，4℃可保存1周，-20℃可保存1年。

6. RNA半衰期比較短，易降解，建議抽提后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

參考用量

表1 每毫升Total RNA Extraction Reagent能夠充分裂解的最大樣本量

注：過(guò)多的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致裂解不充分，并使產(chǎn)物純度降低。

操作流程

1. 樣品的處理

1) 樣品勻漿

A. 貼壁細(xì)胞

棄去培養(yǎng)液，直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，覆蓋并反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。

注：1. 依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是細(xì)胞的數(shù)量來(lái)決定Total RNA Extraction Reagent的所需量（每10 cm2 加1 mL）。

2. 加入Total RNA Extraction Reagent量不足時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DNA污染。

3. 貼壁細(xì)胞往往不能*從培養(yǎng)瓶（皿）脫落，這并不意味著裂解不*。此時(shí)，細(xì)胞膜實(shí)際已*裂開(kāi)，并釋放RNA，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可。

B. 懸浮細(xì)胞

離心收集細(xì)胞沉淀，每5×106-1×107個(gè)細(xì)胞加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，用移液器反復(fù)吹打。

注：加入Total RNA Extraction Reagent前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，否則會(huì)增加mRNA降解的可能性。裂解某些酵母和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。

C. 動(dòng)、植物組織

取-70℃凍存動(dòng)物組織在液氮中充分研磨，按照表1加入適當(dāng)量Total RNA Extraction Reagent混勻?；蛉⌒迈r動(dòng)植物組織盡量剪碎，加入適當(dāng)量Total RNA Extraction Reagent，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。

注：樣品體積不要超過(guò)加入Total RNA Extraction Reagent體積的10%。

2) 將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置5分鐘以使核蛋白體*解離。

3) （可選）4℃，12000 g 離心10 min，取上清。

注：離心可去除樣品中較多蛋白質(zhì)、脂肪、多糖或肌肉，植物的塊莖結(jié)節(jié)等。離心后的沉淀中包含有細(xì)胞外膜、多糖以及高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時(shí)，上層是大量油脂應(yīng)盡量去除，取澄清的勻漿液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 總RNA提取
1) 向上述裂解液中加入1/5體積氯仿（如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入0.2 mL氯仿）。蓋緊離心管蓋，劇烈震蕩15 sec，室溫靜置2-3 min。

2) 4℃，12000 g 離心10-15 min。

注：1. 離心后混合物可分3層：上層無(wú)色水樣層，中間層，下層紅色有機(jī)苯|酚氯仿層。RNA存在于水樣層中。
      2. 上層容量約為所加Total RNA Extraction Reagent總量的50-60%。如加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，上層水相約為500-600 μL。建議吸取400-500 μL，以防吸到中間層造成DNA污染。
      3. 有機(jī)相和中間層是蛋白和DNA，可用于后續(xù)抽提。
3) 小心吸取上層水相至新離心管中，加入1/2體積異丙醇（如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入0.5 mL 異丙醇）。顛倒混勻后室溫放置10 min。

4) 4℃，12000 g 離心10 min。

注：RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。
5) 小心棄去上清，加入等體積 75%乙醇（DEPC水配制，如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入1 mL 75%乙醇）。渦旋充分洗滌，并輕彈管底，讓沉淀懸浮起來(lái)。

6) 4℃，7500 g 離心5 min，棄上清，注意不要丟失RNA沉淀。

注：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸到沉淀。

7) 室溫放置空氣干燥5-10 min。加入30-100 μL 無(wú)RNase水溶解RNA，待*溶解后，取少量檢測(cè)，其余溶液-70℃保存。

注：RNA沉淀不能*干燥，過(guò)分干燥會(huì)導(dǎo)致RNA溶解度降低。

3 產(chǎn)物檢測(cè)

A. RNA完整性檢測(cè)

1) 取1 μL RNA加入適當(dāng)RNA loading buffer，混勻。

2) 進(jìn)行電泳檢測(cè)。若出現(xiàn)清晰的三條帶，證明RNA完整性較好。

B. RNA純度檢測(cè)

檢測(cè)260 nm，280 nm OD值，并計(jì)算A260/A280比值。純的RNA的比值應(yīng)在2.0左右。

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