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普通PCR引物與qPCR引物的對(duì)比
普通PCR和熒光定量PCR的檢測(cè)方式具有較大的差別。熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過(guò)檢測(cè)插入DNA中核酸染料的量來(lái)測(cè)定PCR最終產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過(guò)擴(kuò)增曲線進(jìn)行精確定量，普通PCR則是通過(guò)電泳的方式進(jìn)行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)方面，有什么相同點(diǎn)和不同點(diǎn)呢？今天小編就給大家匯總一下。
相同處：
? 序列的查找是一致的。
? 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段。
? 選取合適的擴(kuò)增片段大小。
? 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)。
? 避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
? Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
? 引物之間的Tm相差避免超過(guò)2℃。
? 引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。
不同處：
熒光定量PCR 引物
? PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：要求在300bp以內(nèi)，一般80-150bp之間。
? 引物特異性：對(duì)引物要求高，盡量減少引物二聚體的產(chǎn)生，熔解曲線要求單一產(chǎn)物。
? 擴(kuò)增效率：熒光定量 PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對(duì)定量，擴(kuò)增效率應(yīng)在90%—110%之間。
? 多對(duì)目的基因同時(shí)擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來(lái)的引物條件會(huì)不同，需要設(shè)計(jì)盡可能條件一致的引物。
? 目的基因含量比較低時(shí)，需要設(shè)計(jì)靈敏度比較高的引物。
普通PCR 引物
? 普通PCR的擴(kuò)增長(zhǎng)度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。
? 相對(duì)于熒光定量PCR，普通PCR對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)要求較低。
? 對(duì)擴(kuò)增效率要求不高。
? 可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對(duì)引物退火溫度要求不需要一致。