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PCR蓋緊蓋子試劑蒸發(fā)問題詳解
其實(shí)試劑的蒸發(fā)是PCR實(shí)驗(yàn)中常見的問題之一，影響試劑蒸發(fā)的因素也比較多。
蒸發(fā)是指試劑在PCR實(shí)驗(yàn)過程中，反應(yīng)液在高溫下氣化，又凝結(jié)在管壁或頂蓋上，形成水霧或水珠，或直接從管蓋或覆膜的氣隙中溢出，造成反應(yīng)液濃度變化、反應(yīng)液量減少，有的甚至蒸干，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無效等。
影響試劑蒸發(fā)的因素主要有以下三點(diǎn)：
01熱蓋壓力、溫度
在PCR實(shí)驗(yàn)中，我們一般通過加熱蓋的辦法來防止試劑蒸汽的凝結(jié)，熱蓋溫度一般比反應(yīng)液的溫度高，以防止蒸汽凝結(jié)。
PCR 儀的熱蓋大致可以分為以下四種：非可調(diào)式熱蓋、可調(diào)節(jié)式熱蓋、自適應(yīng)式熱蓋和自動式熱蓋。而可調(diào)節(jié)式熱蓋利用手?jǐn)Q壓緊式，擰不緊會發(fā)生試劑蒸發(fā)，通過增加熱蓋壓力可以盡量減少邊緣蒸發(fā)的現(xiàn)象。有時擰得過緊反而可能出現(xiàn)壓壞管子、擰壞旋鈕的情況。通常，采用電動智能熱蓋，能夠自動感應(yīng)不同高度的耗材，自動壓緊耗材，壓力均勻且恒定，從而能夠減少試劑蒸發(fā)和人工誤差，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。
02耗材形變
對于蒸汽的泄漏，大部分人認(rèn)為是熱蓋的壓力不夠所致。熱蓋的壓力固然很重要，但這僅僅是一個方面，其實(shí)耗材也很關(guān)鍵。
PCR 孔板通常為塑料材質(zhì)，在受熱后發(fā)生膨脹，產(chǎn)生較大地變形，用于放置 PCR 孔板的 PCR 金屬基座則受熱膨脹率極小，PCR 孔板受熱膨脹后不能正常沿平面延展進(jìn)而中間形成拱起狀態(tài)，從而造成上方熱蓋不能全面地與 PCR 孔板上表面充分接觸，造成溫度、壓力不均，引起 PCR 孔板邊緣試劑的蒸發(fā)，影響 PCR 檢測效果。
03耗材密封不嚴(yán)
熱蓋與耗材壓緊并不等于蓋緊了 PCR 管蓋，PCR 孔板質(zhì)量參差不齊。優(yōu)質(zhì)的耗材，管口和蓋子表面光滑，盒蓋后密封性好，不易泄漏。而劣質(zhì)耗材，管口不平，有徑向紋路，容易造成泄漏，甚至蒸干。
因此在PCR實(shí)驗(yàn)中，盡量選擇優(yōu)質(zhì)、合適的耗材。同時也可以擴(kuò)大反應(yīng)體系，盡量減少體系蒸發(fā)對反應(yīng)的影響。