甲狀腺球蛋白抗原

BNP和NT-proBNP自由血漿，EDTA

貓編號# 8BFP

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NT-proBNP自由血漿

• 貓編號。

8BFP

• 來源：

混合正常人EDTA血漿。

對獻血者采集的血樣進行了檢測，結(jié)果為乙肝表面抗原（HBsAg）、人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和2型（HIV-2）抗體及丙型肝炎病毒（HCV）陰性。

• 應(yīng)用：

BNP和NT-proBNP游離血漿不含完整的前BNP分子和任何前BNP片段（BNP和NTproBNP）。它可以用于制備任何前BNP相關(guān)標準品和校準品，用于基于檢測任何種類的前BNP相關(guān)肽的免疫分析。

• 凈化：

免疫親和層析法分離混合的人正常血漿。

用于親和柱的凝膠是通過將具有不同表位特異性的抗BNP和抗NTproBNP單克隆抗體與BrCN活化的Sepharose CL 4B偶聯(lián)制備的。

• 展示：

冷凍液體。

• 存儲：

-20 °C（允許 -15 … -30 °C）

• 材料安全注意事項：

此產(chǎn)品僅售用于研究或進一步制造。處理此材料時應(yīng)遵循標準實驗室操作程序。

以下是為您翻譯的《人proBNP、BNP和NT-proBNP技術(shù)說明》，在翻譯過程中，我嚴格遵循了醫(yī)學領(lǐng)域的專業(yè)術(shù)語規(guī)范，并保留了原文的格式結(jié)構(gòu)：

 技術(shù)說明

血液凝固與貧血 • 骨代謝 • 心臟標志物 • 生育與妊娠 • 激素標志物 • 免疫學與血清學 • 傳染病 • 炎癥 • 腎臟疾病 • 代謝綜合征 • 神經(jīng)科學 • 甲狀腺疾病 • 腫瘤標志物 • 獸醫(yī)學 

 人proBNP、BNP和NT-proBNP 

腦鈉肽（BNP）及其前體proBNP的N末端部分（NT-proBNP）是已確立的心力衰竭（HF）診斷和預后生物標志物。心力衰竭是一個嚴峻的臨床和公共衛(wèi)生問題，其患病率和經(jīng)濟成本持續(xù)上升。根據(jù)美國心臟協(xié)會的數(shù)據(jù)，美國有650萬人患有心力衰竭，每年新增病例近100萬（1）；全球范圍內(nèi)，患病率超過2300萬人。慢性心臟病、高血壓和糖尿病是已知的危險因素，且65歲以上人群的心力衰竭患病率更高。心力衰竭與顯著的發(fā)病率和死亡率相關(guān)。 

 BNP、NT-proBNP和proBNP作為診斷標志物 

臨床指南建議在疑似急性心力衰竭患者的初始評估中測量BNP或NT-proBNP，以排除心力衰竭。這兩種標志物也可用于監(jiān)測疾病進展。BNP和NT-proBNP的臨床價值相似（2-3），目前均在臨床實踐中應(yīng)用。 

在健康成年人中，血漿BNP的上限為35 pg/ml，NT-proBNP的上限為125 pg/ml（4）。然而，這些值取決于年齡和性別，老年人和女性的值更高。 

分析物的濃度與疾病嚴重程度相關(guān)，可升高數(shù)百倍。有報道稱，在心力衰竭的極早期（根據(jù)紐約心臟協(xié)會分類為NYHA I期），無癥狀患者的兩種肽濃度已升高。NYHA II期和III期，尤其是IV期患者，血液中BNP和NT-proBNP濃度顯著升高。因此，人體血液中的肽測量廣泛用于疑似心力衰竭患者的評估和疾病嚴重程度的判斷。 

測定BNP或NT-proBNP濃度也有助于不同心臟疾病患者的風險分層。未來會出現(xiàn)并發(fā)癥的患者，其BNP和NT-proBNP濃度顯著高于無并發(fā)癥的患者。在充血性心力衰竭患者中，高BNP或NT-proBNP水平可預測死亡，且與心血管風險相關(guān)。同時，在急性冠脈綜合征患者中，兩種肽的水平升高可預測死亡率和嚴重心力衰竭。 

除NT-proBNP和BNP外，心力衰竭患者的血液樣本中還存在大量其前體proBNP1-108。僅檢測proBNP的檢測方法可能具有更高的分析特異性。 

 臨床應(yīng)用 

- 識別或排除心力衰竭 

- 評估心力衰竭的嚴重程度 

- 預測疾病發(fā)展 

- 監(jiān)測心力衰竭患者的藥物治療 

 proBNP及其衍生物的生物化學 

編碼BNP的基因在心肌細胞中因壓力或容量超負荷引起的心肌牽張而被激活，導致合成一個134個氨基酸殘基（a.a.r.）的細胞內(nèi)前體肽preproBNP。去除信號肽后，前體肽進一步加工，釋放出具有生物活性的BNP（32個氨基酸殘基）和無已知生物活性的NT-proBNP（76個氨基酸殘基）。BNP、NT-proBNP以及未加工的proBNP均分泌到血液中并在人體血液中循環(huán)（見圖1）。BNP從循環(huán)中被有效清除，其半衰期約為20分鐘。NT-proBNP的半衰期更長，為60-120分鐘，這解釋了為什么血液中NT-proBNP的濃度明顯高于BNP。 

 proBNP加工示意圖 

preproBNP翻譯并切割信號肽后形成proBNP，隨后在多個位點發(fā)生O-糖基化，形成T71糖基化狀態(tài)不同的兩部分proBNP：T71未糖基化和該位點糖基化的分子。糖基化會抑制proBNP的后續(xù)加工，只有T71未糖基化的proBNP才能有效加工成BNP和NT-proBNP。未加工的proBNP、NT-proBNP和BNP釋放入血。 

proBNP是一種O-糖基化蛋白，已鑒定出7個糖基化位點（5）。所有糖基化位點均位于NT-proBNP部分，而BNP未被糖基化。 

我們之前的研究表明，氨基酸T71的糖基化狀態(tài)對proBNP加工成BNP和NT-proBNP至關(guān)重要。T71位于切割位點附近，只有當T71未被糖基化時，依賴轉(zhuǎn)化酶的切割才能發(fā)生。因此，循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的大部分未加工proBNP在T71上帶有O-聚糖，而NT-proBNP中的同一氨基酸未被糖基化（6）。 

 免疫測定開發(fā)試劑 

在Hytest，我們多年來一直致力于研究proBNP及其衍生物，并在同行評審期刊上發(fā)表了多篇文章（詳情見第10-11頁）。我們提供多種經(jīng)過充分表征的單克隆抗體（MAbs），可用于開發(fā)靈敏可靠的免疫測定方法，適用于臨床樣本中proBNP、NT-proBNP和BNP的檢測。 

我們還提供不同的重組抗原，可作為免疫測定中的標準品和校準品。 

 BNP檢測開發(fā) 

人BNP是一種3.5 kDa的肽，由proBNP切割成NT-proBNP（N端部分）和BNP（C端部分）形成。BNP由proBNP的氨基酸77-108組成，但在BNP分子中，氨基酸通常編號為1-32。BNP的計算等電點為10.95。 

BNP是一種具有利鈉、血管舒張和腎素抑制特性的肽激素（7-9），屬于結(jié)構(gòu)相似的肽激素家族，還包括心房利鈉肽（ANP）、C型利鈉肽（CNP）和尿鈉肽。這些肽的特征是由兩個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成的17個氨基酸的環(huán)結(jié)構(gòu)，不同利鈉肽的環(huán)結(jié)構(gòu)高度同源，17個氨基酸殘基中有11個相同。在人BNP中，二硫鍵位于C10和C26之間（見圖2）。 

 人BNP示意圖及不同蛋白酶的主要蛋白水解降解位點 

DPP IV為二肽基肽酶IV，NEP為中性內(nèi)肽酶（腦啡肽酶），IDE為胰島素降解酶。 

BNP是一種不穩(wěn)定分子（10-11）。多項研究表明，心力衰竭患者血漿中的BNP以多種形式存在，N端和C端均被截斷，只有一小部分BNP以完整的BNP1-32分子形式循環(huán)（12）。已報道蛋白酶如二肽基肽酶IV（DPP IV）和中性內(nèi)肽酶（腦啡肽酶，NEP）可降解BNP，分別生成BNP3-32和BNP5-32（13-14）。一些研究表明，胰島素降解酶（IDE）也可將BNP降解為更小的肽（15-16）。BNP蛋白水解降解的已知位點總結(jié)于圖2。 

 人血液中的BNP免疫反應(yīng)形式 

由于proBNP切割成NT-proBNP和BNP的過程不全，且取決于蛋白質(zhì)的翻譯后糖基化，因此BNP和proBNP均釋放入循環(huán)。除非表位被蛋白酶截斷破壞，否則這些形式均可被BNP分子特異性抗體識別。我們使用凝膠過濾分析心力衰竭患者的血漿樣本，并通過高度敏感的抗體對50E1-24C5測量各組分的BNP免疫反應(yīng)性，該抗體對能夠以相同的特異性檢測不同的BNP形式。凝膠過濾研究結(jié)果顯示，BNP檢測在所有樣本中均檢測到兩個具有BNP免疫反應(yīng)性的峰。第一個峰代表proBNP形式，第二個較小的峰代表BNP形式（見圖3）。我們之前的研究表明，人體血液中主要的BNP免疫反應(yīng)形式是未加工的proBNP（17）。 

 常規(guī)BNP夾心免疫測定 

我們提供多種對BNP分子不同表位具有特異性的單克隆抗體（見圖4）。多種不同的單克隆抗體組合可用于開發(fā)高度特異性、靈敏且快速的常規(guī)型夾心免疫測定，適用于人血液中BNP和proBNP的定量測量。表1顯示了常規(guī)夾心免疫測定的推薦抗體對組合。 

所有推薦的捕獲-檢測對均以相同效率檢測BNP肽和未加工的proBNP蛋白（見圖5）。但需要注意的是，市售BNP檢測對proBNP的交叉反應(yīng)性各不相同（18-20）。所有推薦的組合均已用心力衰竭患者的血漿樣本進行測試。由于抗體在不同檢測平臺上的性能可能不同，我們建議在開發(fā)免疫測定時至少嘗試四到五種雙位點單克隆抗體組合，以確保選擇在給定檢測條件和平臺上表現(xiàn)佳的組合。 

作為BNP免疫測定的標準品，我們建議使用重組糖基化proBNP（貨號8GBP3，見第8頁），因為血液中的BNP免疫反應(yīng)性主要由糖基化proBNP代表。 

 NT-proBNP檢測開發(fā) 

NT-proBNP是proBNP的N端部分，由76個氨基酸和7個O-糖基化位點組成，尚未發(fā)現(xiàn)NT-proBNP具有生物活性。其半衰期是BNP的3-6倍，這意味著它在臨床樣本中是一種更穩(wěn)定的標志物。NT-proBNP的臨床價值與BNP相似，計算等電點為8.45，分子量為8.5 kDa，但由于糖基化，其表觀分子量更高（17）。 

 糖基化對NT-proBNP檢測的影響 

我們的研究表明，NT-proBNP的糖基化會對某些抗體的識別產(chǎn)生負面影響。由于O-糖基化，NT-proBNP分子的中央部分（氨基酸殘基28-56）難以被抗體接近，而區(qū)域13-27和61-76則易于識別。 

為了闡明糖基化如何影響NT-proBNP的測量，我們使用兩種檢測方法分析了8名心力衰竭患者去糖基化前后的血漿：一種使用對無糖基化位點區(qū)域具有特異性的抗體（15C4-13G12），另一種使用其中一個抗體對糖基化位點區(qū)域具有特異性的抗體（11D1-13G12）。圖7顯示，去糖基化對后一種檢測有顯著影響。 

 proBNP檢測開發(fā) 

我們和其他人的研究表明，除NT-proBNP和BNP外，心力衰竭患者的血液樣本中還存在大量其前體proBNP1-108（17,25-26）。proBNP的計算等電點為10.12，分子量為11.9 kDa，但由于O-連接糖基化，其表觀分子量更高（26）。 

現(xiàn)有大多數(shù)市售BNP和NT-proBNP檢測均不同程度地與proBNP發(fā)生交叉反應(yīng)，這種交叉反應(yīng)可能會使BNP和NT-proBNP的相關(guān)性更接近proBNP。 

血液中proBNP的水平已被證明與BNP和NT-proBNP高度相關(guān)，并可用于識別在長期隨訪中具有心血管死亡高風險的心力衰竭患者（27）。另一項研究表明，循環(huán)proBNP水平與心血管不良事件風險增加相關(guān)，且獨立于BNP（28）。 

與市售的BNP和NT-proBNP檢測相比，僅檢測proBNP1-108的檢測可能具有更高的分析特異性。 

 重組蛋白 

重組糖基化人proBNP**：我們提供在哺乳動物細胞系中表達的重組proBNP（貨號8GBP3），該蛋白被糖基化，在SDS-PAGE中遷移為表觀分子量在20-25 kDa之間的彌散條帶（見圖15）。我們建議使用糖基化proBNP作為BNP和proBNP免疫測定的標準品。 

在大腸桿菌中表達的人重組（非糖基化）proBNP**：人重組proBNP（貨號8PRO9；氨基酸殘基1-108）在大腸桿菌中表達，除N端額外有一個Met殘基外，該多肽序列與內(nèi)源性蛋白相同。該抗原可被BNP特異性單克隆抗體（貨號4BNP2）以及所有NT-proBNP特異性單克隆抗體（貨號4NT1）識別。根據(jù)Tricine-SDS-PAGE和HPLC研究，proBNP高度純化，純度超過95%。該抗原可作為BNP、NT-proBNP和proBNP免疫測定中的校準品或標準品。 

重組非糖基化NT-proBNP**：人重組NT-proBNP（貨號8NT2；氨基酸殘基1-76）在大腸桿菌中表達，除N端額外有一個Met殘基外，該多肽序列與內(nèi)源性NT-proBNP相同。該抗原可被對NT-proBNP不同部分具有特異性的單克隆抗體（貨號4NT1）識別。根據(jù)Tricine-SDS-PAGE和HPLC研究，NT-proBNP的純度超過95%，該抗原可作為NT-proBNP檢測中的校準品或標準品。 

 抗原 

 產(chǎn)品名稱  貨號  純度  來源

 NT-proBNP, 重組  8NT2  >95%  重組

 ProBNP, 重組  8PRO9  >95%  重組

 ProBNP, 糖基化, 重組  8GBP3  >95%  重組

 耗竭血漿 

 貨號  來源

 BNP和NT-proBNP游離血漿8BFP  混合正常人血漿

請注意，本技術(shù)說明中顯示的結(jié)果是使用體內(nèi)產(chǎn)生的單克隆抗體獲得的，細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的單克隆抗體預計具有與體內(nèi)產(chǎn)生的單克隆抗體相似的性能。

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