產(chǎn)品簡介

Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 是一款可用于Illumina®和MGI®高通量測序平臺的新一代酶切法建庫試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫法比較，本品采用高質(zhì)量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過程。將片段化模塊與末端修復(fù)模塊合二為一，極大的降低了建庫的時間和成本、連接模塊的酶和buffer預(yù)混，簡化了操作流程，極大地降低了建庫的時間和成本，更加適合于自動化建庫。本試劑盒具有更高的文庫轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組等樣本，同時能兼容FFPE DNA樣本的建庫。在前一代建庫試劑盒的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了片段化/末修/加A模塊，降低了試劑對樣本的GC偏好性，提高了末修和加dA尾的效率，提高了試劑的穩(wěn)定性；本試劑盒使用了最新優(yōu)化的連接酶，改善了接頭連接效率。同時，本試劑盒可搭配Illumina®或MGI®的接頭和Primer，用于Illumina®和MGI®高通量測序平臺測序。  

       適用1ng - 1μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本

       高質(zhì)量片段化酶，可隨機(jī)切割雙鏈DNA，酶切片段偏好性低

       片段化、末端修復(fù)/加A一步完成

       強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶，顯著提高文庫質(zhì)量及產(chǎn)量

       適用于FFPE DNA樣本

      嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品信息

組分信息

注：本試劑盒組分兼容Illumina和MGI雙平臺，如果適配完整接頭，需要額外配置專屬于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat#12190 Hieff NGS® DNA Library Prep Primer Mix for Illumina®或Cat#12191 Hieff NGS® DNA Library Prep Primer Mix for MGI®)。

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時對各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為1 ng ~ 1μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，建議將DNA稀釋在ddH2O中進(jìn)行片段化。

3. 對于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時間參考表5，本試劑盒片段化偏好性低，耐受各種GC含量的模板。以上為推薦時間，需客戶在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)，以達(dá)到優(yōu)良效果。

4. 為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，片段化反應(yīng)配制過程請于冰上操作。

三、關(guān)于接頭連接 (Adapter Ligation)

1. 針對Illumina®測序平臺，Yeasen可提供如下接頭：

a. Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；

b. Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®(Cat#12412~Cat#12413)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；

c. Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®，Set1~Set4（板式） (Cat#12312~Cat#12315)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；

d. Hieff NGS® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371），試劑盒中的接頭濃度為15 μM。

2.針對MGI® 高通量測序平臺，Yeasen可提供如下接頭：

a. Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；

b. Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®，Set 1~Set 4（板式） （Cat#13536 ~ Cat#13539），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；

c. Hieff NGS® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)雙端UMI UDB短接頭，試劑盒中的接頭濃度為10 μM。

3. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產(chǎn)量；使用Adapter時根據(jù)Input DNA量用TE Buffer進(jìn)行相應(yīng)稀釋。 

表1和表2分別列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對Illumina® or MGI®測序平臺常規(guī)和UMI Adapter的稀釋方法。

表1  1ng~1 μg Input DNA針對Illumina®測序平臺推薦常規(guī)和UMI Adapter使用濃度

表2  1ng~1μg Input DNA針對MGI®測序平臺推薦常規(guī)和UMI Adapter使用濃度

四、關(guān)于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量小于50 ng，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長度分選時，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時請用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3~5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4℃可保存1~2周，-20℃可保存1個月。

五、關(guān)于文庫擴(kuò)增 (Library Amplification)

文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表3列舉了使用本試劑盒，獲得1μg文庫的推薦循環(huán)數(shù)。

表3  100 pg~1 μg Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

【注】如果使用了不完整的接頭，需要擴(kuò)增1~3個循環(huán)，形成完整的接頭。建庫過程中若進(jìn)行片段分選，擴(kuò)增時請參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。

六、關(guān)于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測。

使用說明

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：接頭詳細(xì)介紹信息參考上面注意事項(xiàng)中的第三部分“關(guān)于接頭連接”。

4. DNA Primer Mix：Cat#12190，DNA Library Prep Primer Mix for Illumina® 或Cat#12191，DNA Library Prep Primer Mix for MGI®

5. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖1 OnePot Pro DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)

該步驟將基因組DNA片段化，同時進(jìn)行末端修復(fù)及dA尾添加。

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表4反應(yīng)體系。

表4  DNA片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表5所示反應(yīng)程序，進(jìn)行DNA片段化，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng)。

表5  DNA片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)程序

【注】：*DNA片段化過程為有效控制片段化效果，避免過度酶切，反應(yīng)程序可預(yù)先設(shè)置4℃，待模塊溫度降至4℃時，將PCR管放入PCR儀。

**對于完整的基因組DNA，酶切時間參考表6。

表6  常規(guī)基因組DNA片段化條件選擇表

不同打斷條件下片段大小分布圖可見“實(shí)施例”部分的圖2~圖4.

3.2 接頭連接 (Adapter Ligation)

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接Illumina®或MGI®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按第三部分推薦的接頭使用濃度，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表7中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表7所示反應(yīng)體系。

表7  Adapter Ligation PCR體系

【注】：*LigationReady Mix比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時離心后使用。

**本公司接頭濃度與常規(guī)商業(yè)化試劑盒一致，Illumina®平臺皆為15 μM，MGI®平臺皆為10 μM；具體的接頭使用量可以參照表1。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表8所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)。

表8  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

【注】：當(dāng)Input DNA量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化 (Post Ligation Clean Up)

3.3.1純化操作步驟

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物。

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 將Adapter Ligation產(chǎn)物充分離心，然后吸取72 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.8×，Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清；待移除大部分上清后可短暫離心再次置于磁力架中，換用10 μL的槍頭吸凈殘留液體。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次，最后一次漂洗結(jié)束，要吸凈乙醇。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出：

1）若產(chǎn)物無需分選則直接加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移取20 μL上清至新的PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2）若產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，則加入102μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移取100 μL上清至新的PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2雙輪分選操作步驟

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3.根據(jù)DNA片段長度要求，參考表9向上述100ul連接產(chǎn)物上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋振蕩或充分顛倒磁珠混勻。

表9  磁珠文庫分選推薦比例

【注】：表中“×”表示上步驟連接產(chǎn)物體積。如文庫插入片段長度為250 bp，連接產(chǎn)物體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Cat#12601)說明書中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表9向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9，總計(jì)漂洗兩次，最后一次漂洗結(jié)束，要吸凈乙醇。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫擴(kuò)增 (Library Amplification)

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表10中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表10所示反應(yīng)體系。

表10  PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

【注】：*Primer Mix針對不同測序平臺，選用與平臺對應(yīng)的Adapter和Primer Mix。

**如果使用的是完整接頭（Cat#13519~Cat#13520），使用DNA Library Prep Primer Mix for Illumina（Cat#12190）試劑盒中的Primer Mix進(jìn)行擴(kuò)增；如果使用的是MGI接頭（Cat#13360 ~ Cat#13362），使用DNA Library Prep Primer Mix for MGI（Cat#12191）試劑盒中的Primer Mix進(jìn)行擴(kuò)增；如果使用了不完整的接頭（Cat#12412~Cat#12413、Cat#12404~Cat#12407），請參照上述試劑盒說明書，使用其中配備的Index Primer進(jìn)行擴(kuò)增。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表11所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表11  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

3.5擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選 (Post Amplification Clean Up/Size Selection)

擴(kuò)增后純化步驟同3.3.1純化操作步驟。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (1.0×，Beads:DNA=1:1)純化文庫擴(kuò)增產(chǎn)物。如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟。

3.6 文庫質(zhì)量控制(Library Quality Analysis)

通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項(xiàng)六。

四、實(shí)驗(yàn)實(shí)例

不同片段化條件得到的插入片段大小

以500 ng 常規(guī)gDNA為模板，使用本試劑盒構(gòu)建文庫，片段化條件為32℃/35℃/37℃分別酶切5/10/ 15/20/30 min，片段化產(chǎn)物1.2x磁珠純化，21 μL ddH2O洗脫，Qubit測定濃度后，回收的插入片段分布如下圖所示。

圖2 32℃不同酶切時間文庫峰圖

圖3 35℃不同酶切時間文庫峰圖

圖4 37℃不同酶切時間文庫峰圖