實驗概念

將目的基因轉錄調控原件構建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達載體，構建成報告基因質粒，使這段序列調控luciferase的轉錄表達。然后將報告基因質粒轉染細胞，給予其不同的處理后裂解細胞，并加入底物熒光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin發(fā)出熒光(強波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉錄調控原件的影響。為避免由于質粒轉染細胞時效率差異所造成的誤差，通常會轉入Renilla luciferase的報告基因質粒作為內(nèi)參(強波長在465nm左右)，即雙熒光報告系統(tǒng)。

實驗流程

（1） 用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉錄因子結合位點。

（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質粒備用。

（4） 擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。

（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。

注意事項：需提前告知相關的基因信息，如名稱、序列、ID等