一、引言

隨著分子生物學(xué)和臨床診斷需求的增長(zhǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)、SNP 分型、轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)、拷貝數(shù)變異研究等領(lǐng)域。羅氏（Roche）LightCycler 96 系列 qPCR 儀器自面市以來(lái)，以其精確的溫控系統(tǒng)、靈活的通量配置及友好的軟件界面，獲得了眾多實(shí)驗(yàn)室的使用認(rèn)可。本文將圍繞 LightCycler 96 的設(shè)計(jì)架構(gòu)、性能參數(shù)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、軟件功能、典型應(yīng)用場(chǎng)景、日常操作與維護(hù)、二手設(shè)備驗(yàn)收要點(diǎn)以及售后服務(wù)支持等方面進(jìn)行全面介紹，為科研機(jī)構(gòu)、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和臨床實(shí)驗(yàn)室提供參考。

二、設(shè)備架構(gòu)與系統(tǒng)組成

LightCycler 96 儀器由機(jī)箱主機(jī)、溫控模塊、光學(xué)探測(cè)單元、觸控屏控制面板和外部配件（如電源線、通信線）組成。機(jī)箱尺寸（約 45 cm × 40 cm × 33 cm）適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置；凈重約 17 kg，可滿足多點(diǎn)移動(dòng)與固定安裝需求。

• 主機(jī)外殼：防塵金屬材料，內(nèi)部設(shè)有風(fēng)道冷卻系統(tǒng)，維持元器件工作溫度。

• 溫控模塊：采用半導(dǎo)體 Peltier 器件加熱與制冷，溫度反饋采樣點(diǎn)分布于底板與蓋板，實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)溫度監(jiān)控。

• 光學(xué)探測(cè)單元：集成 LED 激發(fā)源與光電倍增管（PMT）探測(cè)器，通過(guò)濾光片組選擇不同熒光通道。

• 控制面板：7 英寸觸摸屏，嵌入式操作系統(tǒng)即時(shí)顯示反應(yīng)進(jìn)程和曲線圖。

三、溫度控制系統(tǒng)

1. 溫控精度與均一性

• 溫度控制精度：± 0.1 ℃；

• 平板孔間溫差：≤ 0.3 ℃；

• 多點(diǎn)溫度傳感設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本架底板與蓋板同時(shí)監(jiān)控。

2. 升降溫速率

• 標(biāo)稱最大升溫速率：4.5 ℃/s；

• 標(biāo)稱最大降溫速率：3.5 ℃/s；

• 支持用戶自定義斜率曲線，滿足特定擴(kuò)增協(xié)議要求。

3. 保溫與預(yù)冷功能

• 儀器待機(jī)時(shí)可設(shè)定低溫預(yù)冷（4 ℃）模式，適合冷鏈需求實(shí)驗(yàn)；

• 自診斷功能每次開(kāi)機(jī)執(zhí)行溫度校準(zhǔn)并自動(dòng)記錄校準(zhǔn)報(bào)告。

四、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)

1. 多通道激發(fā)與檢測(cè)

• 激發(fā)光源：四色 LED（Blue, Green, Yellow, Red），覆蓋 450–660 nm 是別；

• 檢測(cè)通道：最多可設(shè)定 5 個(gè)熒光通道，兼容 FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy3 等常用染料；

• 動(dòng)態(tài)濾光片切換時(shí)間：＜ 10 ms，保證快速的多重檢測(cè)執(zhí)行。

2. 探測(cè)器性能

• 光電倍增管（PMT）檢測(cè)，信噪比可達(dá) 1:800；

• 自動(dòng)背景扣除功能，可有效剔除板材及封板膜自發(fā)熒光。

3. 定量范圍與線性度

• 定量檢測(cè)范圍：10^1–10^9 copies；

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸系數(shù)（R2）：≥ 0.995；

• 檢測(cè)限：可檢測(cè)到數(shù)拷貝水平的目標(biāo)序列。

五、軟件平臺(tái)與數(shù)據(jù)分析

1. 界面布局與功能模塊

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)向?qū)В豪孟驅(qū)浇缑嬷鸩皆O(shè)置擴(kuò)增程序、熒光通道與樣本布局；

• 實(shí)時(shí)監(jiān)控面板：實(shí)時(shí)展示每孔擴(kuò)增曲線及熔解曲線，支持多種縮放與對(duì)比分析；

• 模板管理：可儲(chǔ)存、導(dǎo)入、導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)?zāi)０澹涌熘貜?fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

2. 分析方法

• 定性分析：Ct（閾值循環(huán)數(shù)）判定、擴(kuò)增曲線形態(tài)學(xué)檢查；

• 相對(duì)定量：ΔΔCt 法，支持多種內(nèi)參基因設(shè)定；

• 絕對(duì)定量：利用標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線自動(dòng)計(jì)算樣本拷貝數(shù)；

• 熔解曲線分析：可對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線圖譜比對(duì)，檢測(cè)特異性與引物二聚體；

• 多重分型：基于不同熒光通道同時(shí)分析 SNP 位點(diǎn)。

3. 報(bào)告與導(dǎo)出

• 數(shù)據(jù)輸出格式：CSV、Excel、PDF、圖像（JPEG、PNG）；

• 自定義報(bào)告模板：支持添加實(shí)驗(yàn)信息、曲線圖、統(tǒng)計(jì)表格與備注；

• 批量導(dǎo)出功能：可一次性導(dǎo)出多個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

六、典型應(yīng)用場(chǎng)景

1. 基因表達(dá)研究

• 在細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及藥物篩選研究中，通過(guò)熒光標(biāo)記引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)定量；

• 可同時(shí)對(duì)多種轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行監(jiān)測(cè)，適合高通量篩選。

2. 病原體檢測(cè)

• 在公共衛(wèi)生和臨床診斷中，快速檢測(cè)病毒（如流感病毒、冠狀病毒）、細(xì)菌（如結(jié)核分枝桿菌）、真菌 DNA；

• 短循環(huán)時(shí)間可實(shí)現(xiàn) 40 min 內(nèi)的初步定性結(jié)果。

3. 轉(zhuǎn)基因作物與食品安全

• 檢測(cè)樣本中常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因片段（如 35S 啟動(dòng)子、NOS 終止子）；

• 在食品安全監(jiān)管中，對(duì)潛在過(guò)敏原和污染物進(jìn)行定量分析。

4. SNP 分型與拷貝數(shù)變異

• 使用熒光探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的精確定性與分型；

• 拷貝數(shù)變異分析支持基因擴(kuò)增或缺失檢測(cè)。

5. 微生物群落定量

• 配合特定引物組，可針對(duì)環(huán)境樣本或腸道菌群進(jìn)行定量分析；

• 應(yīng)用于生態(tài)學(xué)、疾病模型研究等領(lǐng)域。

七、儀器日常操作與維護(hù)

1. 開(kāi)機(jī)與關(guān)機(jī)流程

• 開(kāi)機(jī)前檢查電源與通信線連接；

• 關(guān)機(jī)時(shí)先關(guān)閉軟件，再按順序斷開(kāi)電源。

2. 試劑與耗材管理

• 建議選用低漂白或無(wú)漂白板材與封板膜，減少背景信號(hào)；

• 熒光探針、引物及酶體系應(yīng)儲(chǔ)存于 ?20 ℃，使用前室溫平衡。

3. 日常清潔

• 每次運(yùn)行結(jié)束后，用無(wú)塵布或?qū)I(yè)鏡頭紙輕拭光學(xué)窗口；

• 樣本架底板可定期用 70% 乙醇擦拭，防止樣本交叉污染。

4. 定期校準(zhǔn)

• 溫度校準(zhǔn)：至少每 6 個(gè)月進(jìn)行一次，可通過(guò)校準(zhǔn)板或標(biāo)準(zhǔn)試劑驗(yàn)證；

• 光學(xué)校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)熒光染料或校準(zhǔn)板檢測(cè)各通道靈敏度。

5. 故障排查

• 軟件異常：重啟軟件或主機(jī)，檢查日志文件；

• 硬件報(bào)警：參考錯(cuò)誤代碼手冊(cè)，必要時(shí)聯(lián)系技術(shù)支持。

八、二手設(shè)備驗(yàn)收要點(diǎn)

1. 外觀檢查

• 機(jī)箱是否平整，無(wú)明顯劃痕或凹陷；

• 樣本架及蓋板運(yùn)動(dòng)是否順暢，無(wú)卡滯。

2. 功能驗(yàn)證

• 溫度響應(yīng)測(cè)試：運(yùn)行經(jīng)典梯度 PCR 程序，記錄升降溫速率與均一性；

• 熒光檢測(cè)測(cè)試：采用標(biāo)準(zhǔn)熒光板和陰性對(duì)照，檢測(cè)信號(hào)線性度與背景水平；

• 軟件操作：創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)、加載模板、執(zhí)行擴(kuò)增、生成并導(dǎo)出報(bào)告。

3. 配件完整性

• 樣本架、光學(xué)封板膜、電源線、通信線及軟件安裝盤(pán)或軟件授權(quán)文件是否齊全；

• 校準(zhǔn)報(bào)告、使用手冊(cè)及售后合同是否隨同交付。

九、典型使用案例

• 高校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
  某大學(xué)生命科學(xué)中心購(gòu)入 LightCycler 96，用于腫瘤轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)研究，月均運(yùn)行 100 板次，結(jié)果重現(xiàn)性優(yōu)良；

• 第三方食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)
  采用本儀器開(kāi)展轉(zhuǎn)基因成分定量分析，支持 ISO17025 及 GMP 質(zhì)量管理體系審核；

• 區(qū)域疾病控制中心
  在流感季節(jié)，將其用于呼吸道病原體核酸檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)日均 500 例樣本篩查。

十、售后服務(wù)與技術(shù)支持

1. 質(zhì)保條款

• 核心部件（溫控模塊、光學(xué)模塊）質(zhì)保期 6 個(gè)月；

• 其他易損件（封板膜、密封圈）質(zhì)保期 3 個(gè)月。

2. 技術(shù)培訓(xùn)

• 提供儀器安裝與使用培訓(xùn)，包含軟件操作與常見(jiàn)問(wèn)題處理；

• 可根據(jù)需求安排上門(mén)培訓(xùn)。

3. 遠(yuǎn)程與現(xiàn)場(chǎng)支持

• 遠(yuǎn)程診斷：通過(guò)專用軟件監(jiān)控運(yùn)行狀態(tài)并分析日志；

• 現(xiàn)場(chǎng)服務(wù)：簽署服務(wù)協(xié)議后，在 48 小時(shí)內(nèi)派遣工程師（限國(guó)內(nèi)主要城市）。

4. 配件與升級(jí)

   ---

   
   

5. 十二、配件及選購(gòu)建議

6. 擴(kuò)展模塊

1. 梯度模塊：可選裝的梯度溫區(qū)附件，可實(shí)現(xiàn)不同溫度條件的平行擴(kuò)增，適合引物退火溫度篩選；

2. 多孔板適配器：支持 384 孔板和 72 條管格式，滿足超高通量需求。

7. 軟件選配

1. 數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（LIMS）接口：可將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)上傳至實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)；

2. 高級(jí)統(tǒng)計(jì)插件：包含聚類分析、主成分分析（PCA）等功能，用于大規(guī)模數(shù)據(jù)挖掘。

8. 耗材與試劑

1. 低漂白微孔板：推薦采用無(wú)漂白或低漂白板材，減少背景熒光；

2. 光學(xué)封板膜：優(yōu)選超低自發(fā)熒光專用膜，保證檢測(cè)靈敏度；

3. 熒光探針體系：羅氏探針試劑盒及多家兼容品牌試劑均可配合使用，用戶可根據(jù)預(yù)算和實(shí)驗(yàn)要求選擇。

9. 選購(gòu)建議

1. 實(shí)驗(yàn)規(guī)模：常規(guī)實(shí)驗(yàn)室建議標(biāo)配 96 孔板，若短期內(nèi)有大量樣本，可考慮同時(shí)采購(gòu)梯度與多孔板適配器；

2. 經(jīng)費(fèi)預(yù)算：二手設(shè)備與全新設(shè)備在初期投入上相差顯著，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室總體預(yù)算與項(xiàng)目周期做綜合決策；

3. 售后服務(wù)：確認(rèn)供應(yīng)商提供的軟件授權(quán)、質(zhì)保期與工程師響應(yīng)時(shí)間；

10. 十三、進(jìn)階實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

11. 數(shù)字 PCR（dPCR）預(yù)實(shí)驗(yàn)

1. 雖然 LightCycler 96 非數(shù)字 PCR 儀，但可用作高靈敏度預(yù)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，對(duì)樣本進(jìn)行初步擴(kuò)增與 Ct 值篩選，為后續(xù)數(shù)字 PCR 定量提供參考；

12. 多重 PCR 優(yōu)化

1. 通過(guò)調(diào)整熒光通道及引物濃度，實(shí)現(xiàn)對(duì) 3–4 個(gè)目標(biāo)序列的同時(shí)檢測(cè)；

2. 借助梯度模塊優(yōu)化不同引物對(duì)的退火溫度，減少非特異擴(kuò)增；

13. 甲基化特異 PCR

1. 配合甲基化敏感探針，進(jìn)行基因組 DNA 甲基化水平定量；

2. 可在常規(guī) qPCR 基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物實(shí)現(xiàn)甲基化與未甲基化序列區(qū)分；

14. miRNA 表達(dá)譜分析

1. 利用干擾性引物和熒光探針體系，對(duì)短小 RNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增與定量；

2. 需要在反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)加入特定的適配器序列；

15. 十四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

16. 問(wèn)題描述	可能原因	解決方案
    Ct 值波動(dòng)大，重復(fù)性差	樣本上機(jī)前溫度不均一；試劑配制不準(zhǔn)確；板材質(zhì)量低	樣本及試劑室溫平衡；使用多通道移液器；選用低漂白板與封板膜。
    擴(kuò)增曲線形狀異常（平緩或遲滯）	引物設(shè)計(jì)問(wèn)題；模板純度不夠；熒光探針失效	重新設(shè)計(jì)引物并做梯度退火溫度預(yù)測(cè)；純化模板或稀釋檢測(cè)；更換熒光探針。
    熔解曲線出現(xiàn)多峰	非特異擴(kuò)增或引物二聚體	檢查熔解曲線溫度范圍；優(yōu)化引物濃度與退火溫度；在擴(kuò)增體系中加入 DMSO 或甘油。
    光學(xué)報(bào)警，無(wú)法讀取熒光信號(hào)	板材與膜貼合不嚴(yán)或位置偏移；光學(xué)窗口臟污	重新貼膜并校正樣本架位置；用無(wú)塵紙或鏡頭紙清潔光學(xué)窗口。
    軟件崩潰或報(bào)錯(cuò)	軟件版本與操作系統(tǒng)不兼容；用戶文件損壞	升級(jí)至最新授權(quán)版本；備份并重新導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)?zāi)０?；?lián)系技術(shù)支持獲取安裝包及補(bǔ)丁。
    溫度不達(dá)標(biāo)或溫差超標(biāo)	溫控模塊老化；散熱風(fēng)扇故障	進(jìn)行溫控模塊校準(zhǔn)或更換；檢查風(fēng)扇及散熱通道是否被堵塞，必要時(shí)清理或更換風(fēng)扇。

17. 十五、技術(shù)參數(shù)匯總（附錄）

18. 參數(shù)類型	指標(biāo)
    孔板通量	96 孔/板，支持兼容 384 孔與條管格式
    溫度控制精度	±0.1 ℃
    溫度均勻性	≤ 0.3 ℃
    最大升溫速率	4.5 ℃/s
    最大降溫速率	3.5 ℃/s
    激發(fā)光源	RGBY 四色 LED
    檢測(cè)通道	最多 5 通道（可選）
    熒光染料兼容性	FAM, HEX/VIC, ROX, Cy5, Cy3 等
    靈敏度	單拷貝級(jí)別
    線性范圍	101–10? copies
    線性回歸系數(shù) (R2)	≥ 0.995
    觸摸屏尺寸	7 英寸
    軟件輸出格式	CSV, Excel, PDF, JPEG, PNG
    通訊接口	USB 2.0 ×2, LAN ×1
    電源要求	AC 100–240 V, 50/60 Hz
    工作環(huán)境溫度	15–30 ℃
    相對(duì)濕度	20–80%（無(wú)冷凝）
    關(guān)機(jī)功耗	＜ 5 W

19. 以上內(nèi)容涵蓋了 LightCycler 96 的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)、性能指標(biāo)、檢測(cè)系統(tǒng)、軟件平臺(tái)、應(yīng)用領(lǐng)域、操作維護(hù)、配件選購(gòu)、進(jìn)階應(yīng)用、常見(jiàn)問(wèn)題及技術(shù)參數(shù)，幫助用戶全面了解該儀器的功能特點(diǎn)及使用要點(diǎn)。