Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism

Keywords: Osteoblast; VEGF; angiogenesis; mechanobiology; miRNA; miRNA-150-5p; osteocyte.

血管生成是成人骨骼發(fā)育、重塑和修復過程中骨形成的重要初始步驟。這導致組織高度血管化，其中內皮細胞和骨骼細胞不斷處于串擾狀態(tài)以促進體內平衡，這一過程由許多環(huán)境信號介導，包括機械負荷。這種通訊的中斷會導致疾病和/或骨折修復不良。

間充質干細胞/基質細胞（MSC）分泌蛋白組的促血管生成作用已得到充分證實，并且是許多利用這種細胞類型進行組織修復的細胞療法的驅動力。有趣的是，MSC 分泌蛋白組的促血管生成特性在機械負荷后增強。成骨細胞和骨細胞也被證明可以調節(jié)血管生成，表明成骨譜系的細胞可以協(xié)調血管形成。此外，雖然成骨細胞的機械激活進一步增強了分泌蛋白組的血管生成特性，但目前尚不清楚骨細胞是否也具有相同的機械驅動反應。

細胞外囊泡（EVs）是一組高度異質性的細胞衍生脂質結構，參與多種生理和病理過程，已成為許多組織（包括骨組織）中細胞間通訊的有效介質。骨細胞已被證明可以釋放促成骨 EV，這些 EV 的再生效力取決于親本細胞的機械激活。然而，成骨細胞和骨細胞衍生的 EVs 的血管生成特性仍然未知。因此，EVs 代表了成熟骨細胞介導血管生成的潛在機制。

基于此，愛爾蘭都柏林圣三一生物醫(yī)學科學研究所團隊進行了深入研究，首先確定成熟骨骼細胞（成骨細胞和骨細胞）是否可以調節(jié)內皮細胞增殖、遷移和血管生成，以及這個過程是否受到機械調節(jié)；其次，研究這種潛在的促血管生成旁分泌信號是否可以通過細胞外囊泡的分泌來介導；最后，探索 EVs 可能通過包裹和遞送促血管生成介質介導血管生成反應的潛在機制。這項研究代表對骨骼中成骨和血管生成的復雜耦合的進一步見解，并表明骨源性 EVs 作為新型血管生成療法的潛力。研究成果發(fā)表于 Journal of Tissue Engineering 期刊題為“Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism”。

為了確定成熟骨骼細胞是否可以協(xié)調血管生成，首先對骨樣細胞MLO-Y4與成骨樣細胞MC3T3 細胞系施加機械剪切刺激（0-3.2?dyne/cm2），檢查了響應從靜態(tài)培養(yǎng)和機械活化成骨細胞和骨細胞收集的條件培養(yǎng)基中的 HUVEC 增殖和募集，發(fā)現(xiàn)內皮細胞的增殖不受從靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞或骨細胞（S-CM）收集的條件培養(yǎng)基的影響，然而，在機械刺激成熟骨骼細胞后，與沒有VEGF培養(yǎng)基的對照組相比，用來自成骨細胞和骨細胞的機械激活條件培養(yǎng)基（MA-CM）處理時內皮細胞增殖顯著增加。內皮細胞的募集同樣受到成骨細胞和骨細胞的影響。靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞和骨細胞的條件培養(yǎng)基引起內皮細胞遷移的小幅度增加，然而，在成骨細胞和骨細胞的機械激活后，與沒有VEGF培養(yǎng)基的對照組相比，內皮細胞募集顯著增加。雖然 MA-CM 對內皮增殖的影響與 VEGF 相似，但在募集方面，VEGF 在兩種類型的成熟骨骼細胞中均顯著優(yōu)于 CM。（VEGF 是一種促血管生成因子，在所有測定中均用作陽性對照。）這些數(shù)據(jù)表明，經受機械刺激的成熟骨骼細胞釋放的旁分泌因子可以增強內皮細胞的增殖和募集，為早期血管生成做準備。

隨后，檢查了從靜態(tài)培養(yǎng)和機械激活的成骨細胞和骨細胞收集的條件培養(yǎng)基對 HUVEC 管形成的反應（圖1）。與無 VEGF 對照相比，用 10 ng/mL VEGF 處理 18 小時后，明顯可見清晰的小管樣形成（圖1 a）。圖像定量后發(fā)現(xiàn)，VEGF 處理顯著增強了分支的形成、管長和連接密度，證明這種細胞類型如前所述具有血管生成的能力（圖1 b、c）。

用從靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞和骨細胞中收集的 CM 以 1：1 的比例補充 HUVEC 培養(yǎng)基以分析管形成。在靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞和骨細胞的補充組中，18 小時后沒有明顯的血管生成證據(jù)（圖1 a、b、c）。有趣的是，在補充機械激活的成骨細胞和骨細胞 CM 后，兩組的管形成都很明顯，且與補充 VEGF 時情況相同（圖1 a）。此外，圖像量化顯示，與無 VEGF 陰性對照和靜態(tài)培養(yǎng)的骨骼細胞 CM 相比，用機械激活的成熟骨骼細胞 CM 處理導致分支數(shù)量、管長和連接密度在統(tǒng)計學上顯著增加（圖1 b、c）。這些數(shù)據(jù)表明，成熟骨骼細胞通過機械刺激后的旁分泌機制驅動血管生成。

圖1     機械激活的成骨細胞和骨細胞通過旁分泌機制誘導 HUVEC 中的血管形成。

接下來，研究了 EVs 是否可能在機械刺激后成熟骨骼細胞血管生成的調節(jié)中發(fā)揮作用。使用超速離心法從成骨細胞和骨細胞的 CM 中收集 EVs 并對其進行表征，數(shù)據(jù)表明骨樣細胞MLO-Y4與成骨樣細胞MC3T3 細胞系分泌的細胞外囊泡大小、數(shù)量和表面標記物表達相似。

為了評估機械激活的骨細胞衍生的 EVs（MA-EVs）對血管生成的潛在影響，用從機械激活的成骨細胞和骨細胞 CM 中分離的 EVs 處理 HUVECs。此外，還用耗盡 EVs 的 MA-CM 處理 HUVECs，以確定培養(yǎng)基內的可溶性因子是否可能引起血管生成反應。有趣的是，先前增強內皮細胞增殖的成骨細胞和骨細胞 MA-CM 在培養(yǎng)基中耗盡細胞外囊泡后沒有引起任何顯著反應。然而，利用從機械激活的成骨細胞和骨細胞-CM 中分離的 EVs，可以看到內皮增殖顯著增加。在內皮細胞的募集方面，與無 VEGF 對照相比，成骨細胞和骨細胞中耗盡 EVs 的 MA-CM 引起內皮細胞遷移的小幅度增加，而從成骨細胞 MA-CM 中分離的 EV 誘導了遷移更強烈的增加。然而，與耗盡 EV 的 MA-CM 或 VEGF 對照相比，從骨細胞 MA-CM 中分離的 EVs 不會進一步影響內皮細胞募集。這些數(shù)據(jù)表明，經受機械刺激的成熟骨骼細胞釋放的細胞外囊泡可以增強增殖，并在一定程度上增強內皮細胞的募集，為早期血管生成做準備。

進一步檢測了響應機械活化成骨細胞和骨細胞分泌的 EVs 的 HUVEC 管形成（圖2 a）。先前增強血管生成的成骨細胞和骨細胞 MA-CM 在培養(yǎng)基中耗盡細胞外囊泡后沒有引起任何顯著反應（圖2 a、b、c）。然而，在補充從成骨細胞和骨細胞 CM 中分離的機械激活的 EVs 后，兩組的管形成都很明顯，且與 VEGF 陽性對照中觀察到的情況相同（圖2 a）。此外，圖像的量化顯示，與無 VEGF 陰性對照和機械激活的 EVs 耗盡的骨骼細胞 CM 相比，用機械激活的 EVs 處理導致的分支數(shù)量、管長和連接密度在統(tǒng)計學上顯著增加（圖2 b、c），但骨細胞衍生的 MA-EVs 處理后的連接密度除外。這些數(shù)據(jù)表明，成熟骨骼細胞通過機械刺激后的 EV 釋放機制驅動血管生成。

圖2     機械激活的成骨細胞和骨細胞釋放的細胞外囊泡誘導 HUVEC 中的血管形成。

令人驚訝的是，從靜態(tài)培養(yǎng)或機械激活的成骨細胞收集的 CM 中的 VEGF 水平幾乎檢測不到（圖3 a）。雖然機械刺激確實使成骨細胞分泌組中 VEGF 的濃度提高了 ~1.5 倍，但這并不顯著。同樣，成骨細胞來源的 MA-EVs 和耗盡 EV 的成骨細胞 MA-CM 也含有可忽略不計的 VEGF 量。相比之下，骨細胞分泌更高濃度的 VEGF （圖3 c），機械刺激更將其提高了 1.8 倍。有趣的是，在骨細胞來源的 MA-EV 中幾乎沒有檢測到 VEGF，所有 VEGF 都在耗盡 EVs 的 MA-CM 中檢測到，這表明 VEGF 在細胞釋放之前沒有特異性包裹在 EVs 中。這些數(shù)據(jù)表明，成熟的骨骼細胞，特別是骨細胞，分泌促血管生成因子 VEGF，并且這種分泌受到機械調節(jié)，但不包裹在細胞外囊泡內。

由于細胞外囊泡已被證明可以通過 miRNA 的包裹和遞送來介導通訊，其中許多是已知的血管生成的調節(jié)因子，因此研究了 MA-EVs 中的 miRNA 載物。使用高通量測序（miRNA-seq）對靜態(tài)培養(yǎng)和機械刺激的骨細胞釋放的細胞外囊泡內的 miRNA 進行分析，其中122 個 miRNA 顯示出強表達信號。功能過表達分析（ORA）發(fā)現(xiàn)，與基因本體類別相關的 miRNA 顯著富集，如血管重塑、細胞增殖和血管生成的正調控。差異表達分析揭示了兩種不同的 miRNA，與來自靜態(tài)培養(yǎng)的骨細胞條件培養(yǎng)基的 EV 相比，它們在 MA-EV 中顯著上調（mmu-miR-150-5p 和 mmu-miR-2137）。這些數(shù)據(jù)表明，骨細胞釋放含有與血管生成相關的 miRNAs 的細胞外囊泡，這些 miRNAs 在機械刺激下增加。

圖3    成骨細胞和骨細胞分泌低水平的 VEGF，該 VEGF 是機械調節(jié)的，獨立于細胞外囊泡。

總之，該研究展示了一種新的機制，即機械負荷通過從成熟骨骼細胞（如成骨細胞和骨細胞）釋放細胞外囊泡來調節(jié)血管形成。這為研究機械激活的骨骼細胞衍生的細胞外囊泡作為一種促進血管生成和組織再生的新型療法開辟了一條新途徑。因此，骨細胞 MA-EV 可能代表一種多靶點療法，可通過全身或局部遞送進行組織修復。

參考文獻：Shen N, Maggio M, Woods I, C Lowry M, Almasri R, Gorgun C, Eichholz KF, Stavenschi E, Hokamp K, Roche FM, O'Driscoll L, Hoey DA. Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism. J Tissue Eng. 2023 Aug 29;14:20417314231186918. doi: 10.1177/20417314231186918. PMID: 37654438; PMCID: PMC10467237.

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