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蛋白發(fā)光染液:蛋白質檢測的關鍵技術工具

來源:上海易匯生物科技有限公司   2025年06月20日 15:05  
在生命科學研究、生物技術產(chǎn)業(yè)以及醫(yī)學診斷等眾多領域,蛋白質的準確檢測與分析至關重要。蛋白質作為生命活動的主要執(zhí)行者,其表達水平、修飾狀態(tài)以及相互作用等信息,為揭示生命過程的奧秘、疾病的發(fā)生機制以及開發(fā)新型治療方法提供了關鍵線索。蛋白發(fā)光染液作為一種強大的蛋白質檢測工具,通過與蛋白質特異性結合并產(chǎn)生可檢測的發(fā)光信號,實現(xiàn)了對蛋白質的高靈敏度、高特異性檢測,在現(xiàn)代生物學研究中占據(jù)著地位。
一、工作原理
蛋白發(fā)光染液的工作原理基于多種化學反應和物理現(xiàn)象,不同類型的發(fā)光染液具有各自作用機制。目前,應用較為廣泛的蛋白發(fā)光染液主要包括基于化學發(fā)光和熒光發(fā)光兩種類型。
(一)化學發(fā)光染液
以常用于免疫印跡(Western Blot)實驗的增強化學發(fā)光(ECL)染液為例,其核心反應體系涉及辣根過氧化物酶(HRP)和魯米諾。在該體系中,當 HRP 標記的抗體與膜上的目標蛋白特異性結合后,加入含有魯米諾和過氧化氫的 ECL 工作液。在 HRP 的催化作用下,過氧化氫分解產(chǎn)生氧自由基,氧自由基將魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)的 3 -
氨基鄰二甲酸,當激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰苯二甲酸回到基態(tài)時,會以光的形式釋放能量,從而產(chǎn)生化學發(fā)光信號。通過檢測這種發(fā)光信號的強度和位置,即可確定目標蛋白的存在和含量。一些 ECL 發(fā)光染液中還添加了特殊的增強劑,能夠顯著增強發(fā)光信號并延長發(fā)光時間,使其檢測靈敏度可達到飛克(fg,10?1?g)級別,極大地提高了對低豐度蛋白質的檢測能力。
(二)熒光發(fā)光染液
熒光蛋白發(fā)光染液則利用了熒光染料與蛋白質結合后在特定波長光激發(fā)下發(fā)出熒光的特性。例如,DyLight 系列熒光染料,其具有良好的水溶性、pH 不敏感性、高亮度、光穩(wěn)定性以及較長的圖像采集時間等優(yōu)點。這些染料可以通過與蛋白質的氨基或巰基等活性基團共價結合,實現(xiàn)對蛋白質的標記。在合適的激發(fā)光照射下,被標記的蛋白質會發(fā)出特定波長的熒光,通過熒光成像設備檢測熒光信號的強度和分布,從而對蛋白質進行定性和定量分析。不同熒光染料具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜,科研人員可以根據(jù)實驗需求選擇合適的熒光染料,實現(xiàn)對多種蛋白質的同時檢測,即所謂的多重檢測技術。
二、類型與特點
(一)ECL 超敏發(fā)光液
ECL 超敏發(fā)光液在免疫印跡實驗中應用極為廣泛。如美侖生物的飛克特超敏 ECL 發(fā)光液,其對抗原的檢測限可達飛克級,具有靈敏度。在實驗中,一抗(1 mg/mL)儲存液可稀釋 1:1,000 至 1:50,000 倍,二抗(1mg/mL)儲存液可稀釋 1:50,000 至 1:200,000 倍,大大節(jié)省了抗體的使用量。該發(fā)光液的發(fā)光信號持久,結果可通過 X 光膠片曝光或其他熒光成像設備進行檢測。此外,像 EnlightTM 這種超靈敏的 ECL 發(fā)光液,含有發(fā)光增強劑和穩(wěn)定劑,不僅靈敏度高,能檢測到微弱信號,而且在 4℃儲存 1 年以上,信號強度不變。同時,其含有的精準發(fā)光底物可提高信噪比 110 倍以上,在靈敏度更高的同時背景卻更低,發(fā)光時間長達幾小時以上,便于實驗人員進行曝光操作 。
(二)熒光染料類發(fā)光染液
  1. DyLight 系列:DyLight 系列熒光染料涵蓋了從可見光到紅外光區(qū)域的多種產(chǎn)品,如 DyLight 488、DyLight 549、DyLight 649、DyLight 680 和 DyLight 800 等。這些染料的激發(fā)和發(fā)射光譜與常見的激光和濾光片組兼容,在免疫分析、蛋白質印跡、微陣列、細胞染色、流式細胞術和免疫熒光等多種應用中表現(xiàn)出色。例如,在免疫熒光實驗中,DyLight 染料標記的抗體能夠清晰地顯示細胞內目標蛋白的定位和分布,為研究蛋白質的功能和細胞內信號傳導途徑提供了有力工具。苯Pro - Q Diamond 熒光染料:該染料專門用于磷酸化蛋白質的染色。其具有方便、快速、高靈敏度的特點,線性范圍超過 3 個數(shù)量級,并且與質譜鑒定兼容。在 2003 年由 Molecular Probes 的 Wavne Patton 報道,其激發(fā)光波長為 488 nm,吸收峰波長為 532 nm。研究人員通過將一些蛋白質和肽點樣在蛋白質芯片上,使用 Pro - Q Diamond 檢測芯片上蛋白質和肽的磷酸化水平,靈敏度可達 312 - 625 fg,為信號通路和磷酸酶抑制研究提供了良好的平臺 。

  1. ProteOrange® 染料:用于聚丙烯酰胺凝膠電泳后蛋白質的快速可視化。它是一種含有兩性離子片段的芪型熒光團,在核酸、多糖和其他分子存在的情況下,蛋白質 / 十二烷基硫酸鈉膠束(SDS)會選擇性地結合該染料。分子量在 6 kDa 及以上的蛋白質可被有效染色,熒光信號與蛋白質濃度在三個數(shù)量級的濃度范圍內呈線性關系。ProteOrange 凝膠染色的靈敏度約為考馬斯亮藍染色的十倍,雖然低于銀染色,但與銀染色相比,其染色方案要簡單得多,不需要洗滌,對于標準 SDS - PAGE 也不需要固定步驟。整個染色過程 30 - 60 分鐘即可完成,包括將凝膠在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育,然后用 7.5% 乙酸短暫沖洗 30 秒。使用波長為 312 - 365 nm 的透射儀即可進行可視化。

  1. Lumitein™蛋白質凝膠染色劑:設計用于檢測 SDS 聚丙烯酰胺(SDS - PAGE)凝膠中的蛋白質,經(jīng)過額外的 SDS 孵育步驟后,也可用于檢測天然 PAGE 凝膠中的蛋白質。該染色劑具有靈敏度,可檢測到小于 1 ng 的蛋白質,與銀染色靈敏度相當。操作簡單快速,固定和染色可在 30 - 90 分鐘內一步完成,隨后只需用清水簡單沖洗。背景極低,與常見儀器兼容,可使用 300 nm 紫外凝膠盒(EB 濾光片)、Dark Reader 或激光掃描儀進行成像。線性檢測范圍寬,至少可達三個數(shù)量級,并且與下游分析(如質譜和測序)兼容,在室溫下穩(wěn)定性高 。

三、操作流程
(一)免疫印跡(Western Blot)中 ECL 發(fā)光染液的操作
  1. 樣品制備與電泳:首先,將待檢測的蛋白質樣品進行處理,如細胞裂解、組織勻漿等,以提取蛋白質。然后通過十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS - PAGE)根據(jù)蛋白質分子量大小對其進行分離。

  1. 轉膜:將凝膠上分離的蛋白質轉移到固相膜(如 PVDF 膜或硝酸纖維素膜)上,使蛋白質固定在膜上,便于后續(xù)與抗體結合。

  1. 封閉:用含有封閉劑(如 5% 脫脂奶粉或 BSA)的緩沖液孵育膜,封閉膜上非特異性結合位點,減少背景信號。

  1. 一抗孵育:將膜與特異性識別目標蛋白的一抗孵育,一抗與目標蛋白特異性結合。孵育條件通常為 4℃過夜或室溫孵育 1 - 2 小時,具體時間根據(jù)抗體說明書確定。

  1. 二抗孵育:用洗滌緩沖液(如 PBST)充分洗滌膜后,加入與一抗來源物種匹配的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。二抗與一抗結合,從而將 HRP 標記到目標蛋白所在位置。二抗孵育一般在室溫下進行 1 - 2 小時。

  1. 洗膜:再次用洗滌緩沖液充分洗滌膜,去除未結合的二抗,以降低背景信號。

  1. 發(fā)光液混合與孵育:新鮮配制 ECL 工作液,將 A 液和 B 液按照 1:1 的比例混合均勻。將混合后的發(fā)光液均勻覆蓋在膜表面,確保膜浸潤在發(fā)光液中,室溫孵育 1 - 5 分鐘,使發(fā)光反應充分進行。

  1. 信號檢測:孵育完成后,用鑷子小心取出膜,去除多余的發(fā)光液(可將膜輕靠在吸水紙上吸干多余液體,但避免膜干燥)。若使用 X 射線膠片檢測,將膜放入雜交袋中,排出空氣后密封,在暗室中將膠片覆蓋在膜上曝光適當時間(根據(jù)信號強度調整曝光時間,從幾秒到數(shù)小時不等),然后進行膠片顯影和定影處理;若使用化學發(fā)光成像儀檢測,將膜放入成像儀樣品室中,設置合適的曝光時間和增益參數(shù),進行圖像采集和分析 。

(二)熒光染料標記蛋白質的操作流程
  1. 染料選擇與準備:根據(jù)實驗目的和蛋白質特性選擇合適的熒光染料,并按照說明書要求將染料溶解在適當?shù)娜軇┲?,配制成所需濃度的工作液?/span>

  1. 蛋白質標記:將待標記的蛋白質與熒光染料工作液按照一定比例混合,在適當條件下孵育,使染料與蛋白質充分結合。反應條件(如溫度、時間、pH 值等)需根據(jù)染料類型和蛋白質性質進行優(yōu)化。例如,對于一些與氨基反應的熒光染料,通常在中性或弱堿性條件下進行標記反應,孵育時間一般為 1 - 2 小時。

  1. 標記后處理:標記反應完成后,通過透析、超濾或凝膠過濾等方法去除未結合的游離染料,以獲得純凈的標記蛋白質樣品。

  1. 檢測與分析:將標記好的蛋白質樣品用于后續(xù)實驗,如免疫熒光染色、流式細胞術分析等。在檢測過程中,使用相應的熒光激發(fā)光源和檢測設備,根據(jù)熒光信號的強度、分布等參數(shù)對蛋白質進行定性和定量分析。例如,在免疫熒光染色實驗中,將標記蛋白質的樣品與細胞或組織切片孵育,然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號,確定蛋白質在細胞或組織中的定位和表達水平 。

四、應用場景
(一)生命科學研究
  1. 蛋白質表達與功能研究:在探究基因功能時,需要了解基因表達產(chǎn)物 —— 蛋白質的表達水平和功能。通過使用蛋白發(fā)光染液,科研人員可以準確檢測蛋白質在不同細胞系、組織或發(fā)育階段的表達變化。例如,在研究腫瘤發(fā)生機制時,利用 ECL 超敏發(fā)光液結合 Western Blot 技術,檢測腫瘤相關蛋白在正常細胞和腫瘤細胞中的表達差異,有助于發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤標志物和治療靶點。在蛋白質功能研究方面,通過熒光染料標記蛋白質,可以實時追蹤蛋白質在細胞內的定位、運動和相互作用,深入了解蛋白質的生物學功能和參與的信號通路 。

  1. 蛋白質修飾研究:蛋白質的修飾(如磷酸化、乙酰化、甲基化等)對其功能具有重要調節(jié)作用。Pro - Q Diamond 等專門用于檢測特定修飾蛋白質的發(fā)光染液,為研究蛋白質修飾提供了有力手段。通過檢測修飾蛋白質的含量和分布變化,研究人員可以揭示蛋白質修飾在細胞生理過程、疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制 。

(二)生物技術產(chǎn)業(yè)
  1. 重組蛋白生產(chǎn)與質量控制:在重組蛋白藥物的生產(chǎn)過程中,需要對重組蛋白的表達、純化和質量進行嚴格監(jiān)控。蛋白發(fā)光染液可用于檢測重組蛋白的表達水平、純度以及是否存在降解產(chǎn)物。例如,在發(fā)酵液中提取重組蛋白后,使用 Lumitein™蛋白質凝膠染色劑檢測蛋白質含量和純度,確保產(chǎn)品質量符合標準。同時,通過熒光染料標記重組蛋白,可以研究其在體內的藥代動力學和藥效學特性,為藥物研發(fā)提供重要數(shù)據(jù) 。

  1. 生物制品檢測:對于疫苗、抗體等生物制品,需要檢測其中蛋白質的含量、活性和穩(wěn)定性。蛋白發(fā)光染液能夠快速、準確地檢測生物制品中的蛋白質成分,保障產(chǎn)品的安全性和有效性。例如,在流感疫苗生產(chǎn)過程中,利用 ECL 發(fā)光染液檢測疫苗中流感病毒蛋白的含量,確保疫苗劑量準確 。

(三)醫(yī)學診斷
  1. 疾病標志物檢測:在臨床診斷中,檢測血液、尿液等體液中的疾病標志物是早期診斷和病情監(jiān)測的重要手段。許多疾病標志物為蛋白質,通過蛋白發(fā)光染液結合免疫檢測技術,可以高靈敏度地檢測這些微量蛋白質。例如,使用 ECL 超敏發(fā)光液檢測血液中的癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)等腫瘤標志物,有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和預后判斷;檢測血清中的心肌肌鈣蛋白等蛋白質標志物,可用于急性心肌梗死的快速診斷 。

  1. 自身免疫性疾病診斷:自身免疫性疾病患者體內會產(chǎn)生針對自身蛋白質的抗體。通過檢測這些自身抗體,結合蛋白發(fā)光染液進行免疫印跡分析,可以輔助診斷自身免疫性疾病。例如,檢測抗核抗體、抗雙鏈 DNA 抗體等自身抗體時,使用熒光染料標記的二抗,通過觀察熒光信號來判斷抗體的存在和滴度,為系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的診斷提供依據(jù) 。

蛋白發(fā)光染液作為蛋白質檢測的關鍵技術工具,以其高靈敏度、高特異性和多樣化的應用方式,在生命科學研究、生物技術產(chǎn)業(yè)和醫(yī)學診斷等領域發(fā)揮著不可替代的重要作用。隨著技術的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,蛋白發(fā)光染液將不斷優(yōu)化和完善,為推動生命科學研究的深入發(fā)展和人類健康事業(yè)的進步提供更強大的支持。



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