一、菌種簡(jiǎn)介

發(fā)根農(nóng)桿菌是一類宿主范圍廣泛的G-土壤桿菌。農(nóng)桿菌在侵染植物后，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量高度分支的不定根，通常稱為發(fā)根。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物所產(chǎn)生的發(fā)根具有生長(zhǎng)速度快、分化程度高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定、易于進(jìn)行操作控制等特點(diǎn)。

二、基本信息

拉丁學(xué)名：Ag.rhizogenes

界：細(xì)菌界

科：根瘤菌科

屬：農(nóng)桿菌屬

分布區(qū)域：植物發(fā)根

中文學(xué)名：發(fā)根農(nóng)桿菌

三、菌株定義

土壤發(fā)根農(nóng)桿菌(Ag.rhizogenes)是一種侵染性非常廣泛的土壤細(xì)菌，能侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物而誘發(fā)發(fā)根瘤。這是由其所攜帶的Ri質(zhì)粒(Rootinducingplasmid)所引起的。Ri質(zhì)粒上含有負(fù)責(zé)發(fā)根瘤自主性生長(zhǎng)和冠癭堿合成的基因。在結(jié)構(gòu)上，與Ti質(zhì)粒相似，它主要具有Vir區(qū)、T-DNA區(qū)及其內(nèi)的冠癭堿合成功能區(qū)等。

四、形態(tài)特征

發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒誘發(fā)植物細(xì)胞大量繁殖，形成發(fā)根瘤。它與根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒所誘發(fā)的冠癭瘤有相似之處，也有其的特征。兩者相似于：

（1）根癌農(nóng)桿菌的大質(zhì)粒Ti質(zhì)粒是誘發(fā)冠癭瘤所必須的，發(fā)根農(nóng)桿菌的大質(zhì)粒Ri質(zhì)粒是誘發(fā)發(fā)根瘤所的，兩種瘤都是由大質(zhì)粒所引起的；

（2）發(fā)根農(nóng)桿菌所感染的植物組織細(xì)胞必須進(jìn)入下一步發(fā)育途徑，即毛根的形成。另外，在一些宿主植物上，發(fā)根農(nóng)桿菌產(chǎn)生象瘤一樣的冠癭，而不是發(fā)根瘤。

（3）發(fā)根瘤組織產(chǎn)生農(nóng)桿堿(Agropine)，它是一種首先在章魚(yú)堿型冠癭瘤中發(fā)現(xiàn)的冠癭堿。發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物，有時(shí)只產(chǎn)生無(wú)結(jié)構(gòu)的瘤組織，多數(shù)情況下形成大量的毛根。毛根在離體條件下培養(yǎng)，能夠再生出完整的植株，這使發(fā)根農(nóng)桿菌在植物轉(zhuǎn)化方面于根癌農(nóng)稈菌。

五、菌株分類

根誘導(dǎo)質(zhì)粒( root inducing plasmid, Ri質(zhì)粒)是發(fā)根農(nóng)桿菌( Agrobacterium rhizogenes)染色體外的遺傳物質(zhì)。在帶有完整T-DNA的Ri質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中都能檢測(cè)到一類特殊的非蛋白態(tài)的氨基酸，這一類氨基酸被總稱為冠癭堿。在Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞中檢測(cè)到的冠癭堿有農(nóng)桿堿( agropine)、農(nóng)桿堿酸( agropinie acid)、農(nóng)桿堿素( agcinopine)A-D、甘露堿( mannopine)、甘露堿酸( mannopinic acid)、黃瓜堿( cucumopine)。

這些冠癭堿合成基因存在于T-DNA上，只能在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，而不能在農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)錄。寄主植物中合成的冠癭堿作為的碳源和氮源供農(nóng)桿菌利用，而對(duì)寄主植物本身則沒(méi)有用處。某一種農(nóng)桿菌類型合成一種或幾種相應(yīng)類型的冠癭堿，人們按照發(fā)根農(nóng)桿菌主要合成的冠癭堿種類來(lái)分類，可將發(fā)根農(nóng)桿菌分為3種菌株類型:農(nóng)桿堿型、甘露堿型和黃瓜堿型。

六、應(yīng)用領(lǐng)域

1、用于獲得轉(zhuǎn)基因植物和培育作物新品種

對(duì)Ri質(zhì)粒T-DNA進(jìn)行改造，可以構(gòu)建出新的具有目的基因和標(biāo)記基因的Ri質(zhì)粒，用改造型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，可以將目的基因?qū)胫参锝M織，并可再生出轉(zhuǎn)基因植物，所以發(fā)根農(nóng)桿菌為遺傳工程改良植物抗性和品質(zhì)提供了一條十分有效的途徑。1985年，Ooms等用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜的子葉，得到轉(zhuǎn)基因油菜，其皺葉等異常表型可以遺傳。同年，Arlette等用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化胡蘿卜，煙草，牽牛等植物葉片，從遺傳轉(zhuǎn)化的毛根再生出完整植株。Comai等用含沙門氏桿菌aroA基因的pRiA4的TL-DNA的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得耐草甘膦(Glyphosate)的轉(zhuǎn)基因植株。Robaglia等用含nptⅡ基因的中間載體的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化根與再生植株。1989年，何玉科用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜等作物，獲得了含其T-DNA的轉(zhuǎn)化根;用發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402的遺傳轉(zhuǎn)化作用，從甘藍(lán)下胚軸切段誘導(dǎo)出含T-DNA的轉(zhuǎn)化根，并由其再生出小植株。1988年，張蔭麟用發(fā)根農(nóng)桿菌15834感染賽莨菪葉片，獲得產(chǎn)生生物堿的轉(zhuǎn)化根;1992年，他又用發(fā)根農(nóng)桿菌感染金蕎麥無(wú)菌苗，誘導(dǎo)出發(fā)根。1999年，王沖之等用發(fā)根農(nóng)桿菌15834感染西洋參無(wú)菌苗切段獲得發(fā)根，PCR分析證實(shí)ro1C序列整合入轉(zhuǎn)化植株的染色體組。

2、用于生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物

利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物真正實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)的還為數(shù)甚少，其主要原因在于植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，有些還需要激素維持，次生代謝物含量太低，以及生產(chǎn)能力不穩(wěn)定等，因而工業(yè)化生產(chǎn)的成本太高。發(fā)根能合成植物特征的次生代謝產(chǎn)物，而且其含量往往比植物的含量還高，尤其是它的穩(wěn)定性和生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)是工業(yè)化生產(chǎn)所夢(mèng)寐以求的，因此發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)將成為次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的一條可靠和有效途徑。國(guó)外在這方面的研究較為深入，大都從大規(guī)模生產(chǎn)及其生產(chǎn)工藝入手，國(guó)內(nèi)這方面的研究起步較晚，但也取得了一些成就。

人參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞及再生根中人參皂甙含量較高，但由于其生長(zhǎng)需激素維持，因而不能作為藥品上市，Yoshikawa和Furuya通過(guò)人參愈傷組織誘導(dǎo)出發(fā)根，在無(wú)外源激素的條件下，人參皂甙(Rb和Rg)含量高達(dá)干重的0.95%，高于再生根(0.91%)和天然栽培根(0.4%)。Shimomura等誘導(dǎo)紫草再生植株產(chǎn)生的發(fā)根在2L氣升式反應(yīng)器中生長(zhǎng)迅速，每天可回收5mg紫草色素，且可連續(xù)生產(chǎn)220d。天花粉蛋白是由多年生栝樓的塊根制成，近年來(lái)的研究表明天花粉蛋白能夠選擇性地抑制愛(ài)滋病病毒HIV的復(fù)制，并能抑制絨毛膜上皮癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，從地下挖取塊根勢(shì)必會(huì)造成資源浪費(fèi)，邱德有等用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601建立了栝樓發(fā)根的離體培養(yǎng)系統(tǒng)，每克鮮重栝樓發(fā)根中天花粉蛋白的含量達(dá)8.16mg;紫杉醇是從紅豆杉屬植物樹(shù)皮和針葉中分離的一種四環(huán)二萜酰胺類化合物，被稱為是過(guò)去幾十年中發(fā)現(xiàn)的抗癌藥物，紫杉醇在植物體中的含量極低，國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室都在開(kāi)展利用發(fā)根生產(chǎn)紫杉醇的研究，由于紫杉醇的市場(chǎng)潛力很大，許多研究結(jié)果沒(méi)有公開(kāi)發(fā)表，黃遵錫等報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌A4對(duì)短葉紅豆杉芽外植體的轉(zhuǎn)化，并檢測(cè)到發(fā)根中紫杉醇的含量為愈傷組織的1.3-8.0倍，且發(fā)根在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，還可向培養(yǎng)液中分泌0.01-0.03mg/L的紫杉醇;長(zhǎng)春堿的長(zhǎng)春新堿是存在于長(zhǎng)春花中的具有抗癌作用的雙體吲哚生物堿，Parr等通過(guò)誘導(dǎo)長(zhǎng)春花形成發(fā)根，從發(fā)根中檢測(cè)到了長(zhǎng)春堿;Tada等用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)芳香植物羅勒獲得的發(fā)根培養(yǎng)物在無(wú)激素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好并積累rosmarinicacid，而相關(guān)的酚類化合物很少;1997年，Laurain等用發(fā)根農(nóng)桿菌A4感染銀杏雌性原葉體獲得轉(zhuǎn)化胚芽，用高壓液相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)化胚芽的細(xì)胞培養(yǎng)物中銀杏苦內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的濃度高達(dá)0.087%(干重)，高于未轉(zhuǎn)化的同源細(xì)胞培養(yǎng)物(0.065%);Kittipongpatana等發(fā)現(xiàn)SolanumaviculareForst的發(fā)根中澳洲茄胺的含量高達(dá)6.2mg/g(干重)，高于愈傷組織(1.4mg/g)和細(xì)胞懸液(0.7mg/g);Inokova等發(fā)現(xiàn)不同菌株對(duì)紫云英無(wú)菌苗誘導(dǎo)發(fā)根的能力、發(fā)根生長(zhǎng)速度、皂苷的產(chǎn)量均有影響，轉(zhuǎn)化根在沒(méi)有和植物激素的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基中加入谷固醇后，皂苷產(chǎn)量有明顯增加;Tana-ka等用發(fā)根農(nóng)桿菌感染風(fēng)鈴草獲得轉(zhuǎn)化根，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化根中產(chǎn)生3-葡萄苷花青素、3-蕓香苷花青素及黃酮類化合物等，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)光照和BA有助于花青素的積累;Yu和Kanokwaree等還研究了氧氣對(duì)顛茄發(fā)根生長(zhǎng)的影響。劉春朝和劉本葉等對(duì)青蒿發(fā)根的培養(yǎng)條件和生物合成動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究;鄭志和等對(duì)黃芪發(fā)根的大量培養(yǎng)和發(fā)根中化學(xué)成分及免疫功能活性進(jìn)行了研究。這些實(shí)驗(yàn)表明，親本植株能合成的次生代謝物可用發(fā)根培養(yǎng)物來(lái)生產(chǎn)，因而被認(rèn)為是一條利用生物技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物(如藥物、天然色素、香料、天然調(diào)味品等)的新的有效途徑，可以說(shuō)這一技術(shù)的出現(xiàn)是次生代謝物研究領(lǐng)域中的一次重大事件。

3、促使植物生根

Ri質(zhì)粒能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生大量毛根，促進(jìn)植物生根，已引起了人們的高度重視，被人們廣泛使用。1985年它被應(yīng)用于蘋果與扁桃的插條以改善生根狀況，從而有益于對(duì)干旱的抵抗。Hatta等發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌能誘導(dǎo)棗樹(shù)的插條生根，Caboni等用野生發(fā)根農(nóng)桿菌1855感染胡桃的微小切口，誘導(dǎo)出發(fā)根;Rinallo等發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA能促進(jìn)榆樹(shù)生根。Ri質(zhì)粒的這一特性對(duì)于難生根植物生根、存活具有重要意義。

4、用于生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物

另外，還可以用Ri質(zhì)粒作為載體通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌向植物基因插入外源基因生產(chǎn)外源基因產(chǎn)品，Stougaaard等用含大豆血紅蛋白基因的農(nóng)桿堿型質(zhì)粒pRi15834(中間載體)誘發(fā)牛角花產(chǎn)生毛根，并由毛根獲得基因表達(dá)的再生植株。發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷史雖然較短，但Ri質(zhì)粒作為植物基因工程載體已顯示出其可行性與方便性，隨著研究的深入，它將會(huì)成為比Ti質(zhì)粒更理想的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，更多的次生代謝物將會(huì)通過(guò)發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)，并被用于難以插活植物的生根和生產(chǎn)外源基因產(chǎn)品。

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