Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress

Keywords: trabecular meshwork, glaucoma, tubulin acetylation, mechanical stress

小梁網(wǎng)（TM）/Schlemm 管（SC）常規(guī)流出通道中的機(jī)械力被認(rèn)為在調(diào)節(jié)房水（AH）穩(wěn)態(tài)和眼壓（IOP）中起關(guān)鍵作用。由于脈動(dòng)或活動(dòng)（如眨眼和掃視）引起的壓力差和眼壓波動(dòng)，流出通道內(nèi)的細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷拉力或機(jī)械拉伸。此外，流出通道細(xì)胞在流經(jīng) TM 和 SC 組織時(shí)會(huì)受到 AH 流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力。

機(jī)械拉伸會(huì)觸發(fā)細(xì)胞骨架中的動(dòng)態(tài)響應(yīng)，根據(jù)應(yīng)力的大小和持續(xù)時(shí)間，細(xì)胞骨架可能會(huì)流化以適應(yīng)力或加強(qiáng)以抵抗力。這種機(jī)械反應(yīng)涉及細(xì)胞骨架成分（包括微管）之間的復(fù)雜協(xié)調(diào)，微管在感應(yīng)機(jī)械力和穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵作用。大量研究表明，TM 和 SC 細(xì)胞都可以感知機(jī)械力并通過(guò)觸發(fā)旨在調(diào)節(jié)各種流出阻力的細(xì)胞過(guò)程（包括細(xì)胞骨架重塑）來(lái)做出反應(yīng)。但目前還沒(méi)有研究探討機(jī)械拉伸與 TM 和 SC 細(xì)胞中微管（MT）細(xì)胞骨架之間的關(guān)系。

微管蛋白乙?；?，特別是在 α-微管蛋白第40位的賴氨酸（K40）殘基上，是一種與 MT 的穩(wěn)定性和機(jī)械特性相關(guān)的關(guān)鍵翻譯后修飾。微管蛋白乙?；鰪?qiáng)了微管的柔韌性和彈性，對(duì)機(jī)械應(yīng)力起到保護(hù)作用并防止結(jié)構(gòu)損傷。

最近，在美國(guó)杜克大學(xué)眼科中心及俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)凱西眼科研究所的一項(xiàng)研究中，探討了對(duì)照組和青光眼組 TM 細(xì)胞微管蛋白乙?；憫?yīng)循環(huán)機(jī)械拉伸（CMS）的動(dòng)態(tài)調(diào)控和功能意義，以及微管蛋白乙?；瘜?duì)小鼠體內(nèi) IOP 的作用。這是第一項(xiàng)探索微管蛋白乙?；诹鞒鐾ǖ绖?dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)中的功能研究。研究成果發(fā)表于 Investigative Ophthalmology & Visual Science 期刊題為“Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress”。

首先，使用蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光分析研究了在有和沒(méi)有 CMS （8% 伸長(zhǎng)率）的人眼小梁網(wǎng)細(xì)胞（HTM）原代培養(yǎng)物中賴氨酸40 （Ac-TUBA4）處 ?-微管蛋白乙?；陌l(fā)生情況。結(jié)果顯示，TM 細(xì)胞中 Ac-TUBA4 的組成型基礎(chǔ)水平（圖1 A）。與未拉伸對(duì)照相比，拉伸處理培養(yǎng)物中 Ac-TUBA4 水平顯著升高。免疫熒光證實(shí)，CMS 作用下 Ac-TUBA4 增加（圖1 B、C）。還觀察到細(xì)胞定位的變化。Ac-TUBA4 主要位于未拉伸細(xì)胞的核周區(qū)域，并且在拉伸細(xì)胞中顯示出更廣泛的細(xì)胞質(zhì)染色。這表明，循環(huán)機(jī)械拉伸在 TM 細(xì)胞中誘導(dǎo)微管蛋白乙酰化。

MT管腔內(nèi)通過(guò)α-微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（α-ATAT1）對(duì)α-微管蛋白進(jìn)行K40乙?；S后通過(guò)HDAC6和SIRT2進(jìn)行脫乙?；Ｌ禺愋郧玫?ATAT1、HDAC6 和 SIRT2，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)估 Ac-TUBA4、SIRT2 和 HDAC6 的水平。與對(duì)照細(xì)胞相比，敲低 ATAT1 導(dǎo)致 Ac-TUBA4 水平顯著降低，相反，敲低 HDAC6 導(dǎo)致 Ac-TUBA4 水平增加，而敲低 SIRT2 沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果表明，ATAT1 和 HDAC6 分別調(diào)節(jié) TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙酰化和脫乙?；?/span>

隨后檢查了這些酶的表達(dá)在 CMS 條件下是否發(fā)生改變。與未拉伸培養(yǎng)物相比，CMS 顯著降低了 HDAC6 蛋白水平。SIRT2 水平略有下降，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未觀察到 CMS 下 ATAT1 mRNA 水平發(fā)生變化。這些發(fā)現(xiàn)表明，CMS 通過(guò)下調(diào) HDAC6 來(lái)增加 Ac-TUBA4，從而降低微管蛋白脫乙酰化的速率。

圖1     CMS 下 TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；?。

接下來(lái)，使用從受青光眼（GTM）和年齡匹配對(duì)照組（NTM）影響的供體眼睛中分離的 TM 細(xì)胞的原代培養(yǎng)物重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。值得注意的是，在非拉伸條件下，與 NTM 培養(yǎng)物相比，GTM 培養(yǎng)物表現(xiàn)出更高水平的 Ac-TUBA4 （圖2 A）。然而，在 GTM 細(xì)胞和 NTM 細(xì)胞之間未觀察到 HDAC6 或任何 SIRT2 亞型表達(dá)的顯著差異（圖2 A）。CMS 的應(yīng)用進(jìn)一步增加了 GTM 細(xì)胞中 Ac-TUBA4（圖2 B）。這表明，青光眼型 TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；缴?。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，與同齡對(duì)照眼相比，青光眼的 TM 更僵硬。因此，研究了 GTM 細(xì)胞中較高的 Ac-TUBA4 水平是否是由于剛度增加造成的，檢測(cè)在不同基質(zhì)剛度上（5-kPa 和 60-kPa；900-kPa；～1 GPa）培養(yǎng)的 NTM 和 GTM 細(xì)胞裂解物中的 Ac-TUBA4 水平。無(wú)論基質(zhì)剛度如何，與 NTM 細(xì)胞相比，GTM 細(xì)胞始終表現(xiàn)出更高的 Ac-TUBA4 含量。在 NTM 細(xì)胞中未觀察到基質(zhì)剛度對(duì) Ac-TUBA4 水平的影響?？傮w而言，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不支持底物剛度對(duì)微管蛋白乙酰化的直接影響。

圖2    非拉伸和 CMS條件下青光眼 TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；?。

對(duì)其他細(xì)胞類型的研究表明，微管蛋白乙?；谡{(diào)節(jié)細(xì)胞收縮性中的作用。鑒于 TM 細(xì)胞收縮性與 AH 流出的相關(guān)性，在 ATAT1（siATAT1）敲低表達(dá)的 TM 細(xì)胞中進(jìn)行了基于膠原蛋白的凝膠細(xì)胞收縮性測(cè)定，TGFβ2（10 ng/mL）處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。正如預(yù)期的那樣，TGFβ2 處理促進(jìn)了細(xì)胞收縮性，而沉默 ATAT1 表達(dá)導(dǎo)致膠原凝膠松弛，Ac-TUBA4 水平較低。此外，ATAT1 敲低還抑制了 TGFβ2 誘導(dǎo)的收縮性。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 tubacin 的作用，tubacin 是一種有效的 HDAC6 抑制劑，可抑制微管蛋白脫乙?；瑢?dǎo)致乙?；⒐艿鞍缀匡@著增加。出乎意料的是，tubacin 處理導(dǎo)致 TGFβ2 誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮性降低。盡管乙?；⒐艿鞍缀恳叩枚?，但 tubacin處理并未逆轉(zhuǎn)在 siATAT1 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中觀察到的細(xì)胞松弛。

此外，還探討了 Rho 激酶抑制劑是否可以改變微管蛋白乙?；?，結(jié)果表明，在Y27623 處理的 TM 細(xì)胞中未檢測(cè)到 Ac-TUBA4 水平的顯著變化（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)支持 ATAT1 在調(diào)節(jié) TM 細(xì)胞收縮性中的作用，而不是微管蛋白乙?；?。

圖3     Rho 激酶抑制劑對(duì)微管蛋白乙?；挠绊?。

K40 位點(diǎn)微管蛋白的乙酰化被認(rèn)為可提供穩(wěn)定性并防止微管破裂。研究人員旨在確定 tubacin 處理誘導(dǎo)的微管蛋白乙?；缴呤欠窨梢苑乐?nocodazole（一種已知的微管解聚劑）誘導(dǎo)的微管解聚。圖像顯示，tubacin 處理的細(xì)胞中微管彎曲更少、更長(zhǎng)，并且裂縫更少。此外，與 siCNT 轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，nocodazole 處理導(dǎo)致 siATAT1 中更快速和顯著的解聚效應(yīng)，在30 分鐘后幾乎沒(méi)有觀察到可見(jiàn)的完整乙?；⒐堋＿@些數(shù)據(jù)表明，微管蛋白乙酰化可防止 TM 細(xì)胞中的微管破裂。

最后，實(shí)驗(yàn)研究了微管蛋白乙?；瘜?duì) IOP 的影響，將tubacin（10 μM）注射到C57BL / 6J小鼠的前房中，對(duì)側(cè)眼接受DMSO載體對(duì)照注射，記錄晝夜眼壓測(cè)量值（圖4 A、B）。注射 tubacin的眼睛在第 1 天、第 2 天和 第 3 天觀察到眼壓顯著降低，逐漸恢復(fù)到基線水平。這表明 tubacin 對(duì) IOP 的降低作用主要?dú)w因于前房?jī)?nèi)注射而不是局部應(yīng)用，驗(yàn)證了單獨(dú)局部應(yīng)用 tubacin 沒(méi)有顯著的降眼壓作用。通過(guò)免疫熒光證實(shí)，注射tubacin的眼睛的TM和睫狀體中的Ac-TUBA4水平較高（圖4 C）。

圖4    Tubacin 處理可降低小鼠的 IOP。

總之，該研究強(qiáng)調(diào)了微管蛋白乙?；?TM 細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)中的關(guān)鍵作用及其對(duì) IOP 調(diào)節(jié)的潛在影響。機(jī)械拉伸通過(guò)下調(diào) HDAC6 誘導(dǎo) TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；?，從而增強(qiáng) MT 穩(wěn)定性。青光眼 TM 細(xì)胞中微管蛋白乙?；弑砻鞔嬖诘窒黾拥臋C(jī)械負(fù)荷的代償機(jī)制。雖然微管蛋白乙酰化似乎不直接調(diào)節(jié) TM 細(xì)胞收縮性，但它對(duì) MT 不穩(wěn)定起保護(hù)作用。體內(nèi) tubacin 對(duì) IOP 的降低作用強(qiáng)調(diào)了在青光眼治療中調(diào)節(jié)微管蛋白乙?；闹委煗摿ΑＮ磥?lái)的研究應(yīng)探索 ATAT1 對(duì)細(xì)胞收縮性影響的分子機(jī)制，并探討靶向微管蛋白乙酰化在眼生理學(xué)和病理學(xué)中的長(zhǎng)期影響。

參考文獻(xiàn)：Su CC, Desikan V, Betsch K, Shim MS, Keller KE, Liton PB. Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025 Jan 2;66(1):43. doi: 10.1167/iovs.66.1.43. PMID: 39820277; PMCID: PMC11753476.

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