斑馬魚I型膠原蛋白（Col-I）ELISA試劑盒說明書

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中斑馬魚I型膠原蛋白（Col-I）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1. （96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全。

2. 標準品濃度依次為：40、20、10、5、2.5、0 ng/mL

3. 經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

檢測前準備工作：

1. 請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F(xiàn)象；放置室溫，輕搖均勻，待結晶完quan溶解后再配置洗滌液?？蓪?/span>20ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃

3. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。。

實驗原理：

試劑盒采用雙抗體二步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被斑馬魚I型膠原蛋白（Col-I）捕獲抗體包被微孔中，依次加入標本、標準品孵育，加入生物化抗體進行抗體生物素化，經(jīng)過溫育并徹di后加入HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的斑馬魚I型膠原蛋白（Col-I）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6. 樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

注意事項：

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。