一、背景

小鼠肺成纖維細(xì)胞是肺間質(zhì)中數(shù)量最多的細(xì)胞類型之一。這些細(xì)胞與普通的成纖維細(xì)胞相似，但具有一些的特征，例如它們有很長的分枝過程及間隙連接。

小鼠肺成纖維細(xì)胞主要來源于肺組織，肺是機(jī)體的呼吸器官，位于胸腔，左右各一，覆蓋于心之上。肺有分葉，左二右三，共五葉。肺經(jīng)肺系（指氣管、支氣管等）與喉、鼻相連，故稱喉為肺之門戶，鼻為肺之外竅。

成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。它們較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。這些細(xì)胞功能活動旺盛，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動。在一定條件下，成纖維細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化。

小鼠肺成纖維細(xì)胞的主要功能為分泌肺泡隔基質(zhì)中的III型膠原、彈性蛋白以及蛋白多糖，也在肺部受損時擔(dān)任重要的修復(fù)和重建功能。肺部受傷后，在炎癥部位的一定程度的成纖維細(xì)胞積聚是肺部復(fù)原的關(guān)鍵步驟，過多或者不足的成纖維細(xì)胞聚集都會導(dǎo)致肺功能異常。

小鼠肺成纖維細(xì)胞是一種在肺組織中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞類型。它們屬于肺泡間質(zhì)細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生和維護(hù)肺泡的結(jié)構(gòu)完整性，參與肺組織的修復(fù)和再生過程。

在正常情況下，肺成纖維細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，不參與免疫反應(yīng)。然而，在某些病理?xiàng)l件下(如肺部感染、炎癥、損傷或纖維化)，肺成纖維細(xì)胞會被激活并增殖，產(chǎn)生大量的膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)組分，導(dǎo)致肺組織的纖維化和功能受損。

二、小鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇小鼠肺成纖維細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)小鼠肺成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)小鼠肺成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應(yīng)用

小鼠肺成纖維細(xì)胞可以用于麥味養(yǎng)肺湯通過p53抑制肺成纖維細(xì)胞衰老抗肺纖維化的機(jī)制研究：

MWYF在體內(nèi)和體外抑制肺成纖維細(xì)胞衰老的研究：

①體內(nèi):通過衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色觀察小鼠肺組織衰老情況,利用Western Blot檢測衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16在小鼠肺組織中的表達(dá)情況,通過免疫熒光觀察肺組織中成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA與衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16的共染情況。

②體外:提取小鼠肺成纖維細(xì)胞,利用免疫組化對提取的成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定,通過CCK-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)確定MWYF凍干粉給藥劑量。將原代肺成纖維細(xì)胞分為空白組,模型組,MWYF低劑量組(400μg/mL),MWYF中劑量組(600μg/mL)和MWYF高劑量組(800μg/mL)。利用阿霉素(Doxorubicin,DOX)干預(yù)48 h建立細(xì)胞衰老模型,分別用含不同濃度MWYF凍干粉的培養(yǎng)基干預(yù)24h,通過SA-β-Gal染色觀察肺成纖維細(xì)胞衰老情況,利用Western Blot檢測衰老相關(guān)蛋白p53、p21、p16和衰老相關(guān)分泌因子(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)在小鼠肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況。

MWYF在體內(nèi)和體外抑制肺成纖維細(xì)胞衰老的研究:在小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)MWYF能夠降低肺組織中SA-β-Gal活性,減少衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16的表達(dá)水平,同時通過雙熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)MWYF可以減少小鼠肺成纖維細(xì)胞衰老。在體外,發(fā)現(xiàn)MWYF能夠降低肺成纖維細(xì)胞中SA-β-Gal活性,減少衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16的表達(dá)水平,抑制SASP表達(dá)。體內(nèi)和體外結(jié)果均顯示MWYF高劑量組凍干粉效果明顯。

MWYF通過p53抑制肺成纖維細(xì)胞衰老的研究:通過質(zhì)粒載體對肺成纖維細(xì)胞實(shí)現(xiàn)p53基因沉默后發(fā)現(xiàn),MWYF減少小鼠肺成纖維細(xì)胞衰老作用受到抑制,降低p21和p16蛋白表達(dá)能力受到抑制;通過質(zhì)粒載體對肺成纖維細(xì)胞實(shí)現(xiàn)p53基因過表達(dá)后發(fā)現(xiàn),MWYF減少肺成纖維細(xì)胞衰老作用未受抑制,降低p21和p16蛋白表達(dá)能力也未受到抑制。

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