羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀說明書

一、儀器概述

羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀是一種基于實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)的分子生物學(xué)檢測設(shè)備，用于核酸（DNA/RNA）的擴增和定量分析。該儀器采用光學(xué)檢測系統(tǒng)，可在PCR擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號變化，并通過軟件分析計算目標核酸的初始濃度。

LightCycler® 480適用于醫(yī)學(xué)診斷、基礎(chǔ)研究、食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，支持多重PCR檢測，滿足不同實驗需求。

二、儀器組成

1. 硬件部分

• 溫控模塊：采用Peltier半導(dǎo)體溫控技術(shù)，控溫范圍通常為4°C–99°C，升降溫速率可達4.8°C/秒（視具體型號）。

• 光學(xué)檢測系統(tǒng)：

• 激發(fā)光源：LED或鹵素?zé)簦ㄒ曅吞枺?/p>

• 檢測通道：通常支持4–6個熒光通道（如FAM、HEX、ROX、Cy5等），可同時檢測多種熒光信號。

• 樣本承載系統(tǒng)：兼容96孔板或384孔板（視型號），部分版本支持多模塊并行運行。

• 觸摸屏控制面板（部分型號）：可直接進行基本操作和程序設(shè)定。

2. 軟件部分

• LightCycler® 480 Software：提供實驗設(shè)置、數(shù)據(jù)采集、分析和報告生成功能。

• 支持絕對定量、相對定量、熔解曲線分析、基因分型等模式。

• 可導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Excel、PDF等格式。

三、工作原理

實時熒光定量PCR（qPCR）通過監(jiān)測PCR擴增過程中熒光信號的累積來定量目標核酸。LightCycler® 480采用以下兩種主要檢測方式：

1. 基于探針的檢測（如TaqMan探針）：探針與目標序列結(jié)合后，在擴增過程中被酶切，釋放熒光信號。

2. 基于染料的檢測（如SYBR Green）：染料結(jié)合雙鏈DNA后發(fā)出熒光，但可能受非特異性擴增影響。

儀器在每輪PCR循環(huán)后采集熒光信號，生成擴增曲線，并通過閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）計算初始模板量。

四、操作流程

1. 實驗前準備

• 樣本處理：提取DNA/RNA，測定濃度和純度（如A260/A280比值）。

• 試劑準備：

• 選擇合適熒光標記（探針或染料）。

• 配制PCR反應(yīng)體系（模板、引物、探針、酶、dNTPs、緩沖液等）。

• 耗材選擇：使用適配的96孔板或384孔板，避免氣泡影響信號檢測。

2. 儀器設(shè)置

1. 開機與初始化：

• 打開儀器電源，啟動軟件，進行光學(xué)校準（如需要）。

2. 創(chuàng)建實驗程序：

• 設(shè)定PCR循環(huán)參數(shù)（預(yù)變性、變性、退火/延伸、循環(huán)次數(shù)）。

• 選擇熒光檢測通道（如FAM、HEX）。

3. 樣本排布：

• 在軟件中設(shè)定樣本位置，標注標準品、待測樣本、陰性/陽性對照。

3. 運行PCR

• 將反應(yīng)板放入儀器，啟動運行。

• 實時監(jiān)測擴增曲線和熒光信號。

4. 數(shù)據(jù)分析

• 擴增曲線分析：軟件自動計算Ct值，生成標準曲線（絕對定量）或ΔΔCt值（相對定量）。

• 熔解曲線分析（如使用SYBR Green）：確認擴增特異性。

• 數(shù)據(jù)導(dǎo)出：保存或打印結(jié)果。

五、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 醫(yī)學(xué)診斷：

• 病原體檢測（如新冠病毒、HIV、HBV）。

• 遺傳病篩查（如地中海貧血、囊性纖維化）。

2. 科研實驗：

• 基因表達分析（qRT-PCR）。

• SNP分型、突變檢測。

3. 食品安全與農(nóng)業(yè)：

• 轉(zhuǎn)基因成分檢測。

• 食源性致病菌（如沙門氏菌、大腸桿菌）鑒定。

4. 環(huán)境監(jiān)測：

• 水體或土壤中的微生物檢測。

六、注意事項

1. 實驗優(yōu)化

• 引物/探針設(shè)計：確保特異性，避免二聚體或非特異性擴增。

• 反應(yīng)體系優(yōu)化：調(diào)整Mg2?濃度、退火溫度等參數(shù)。

2. 防污染措施

• 分區(qū)操作（試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)）。

• 使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）防污染體系。

3. 儀器維護

• 日常清潔：定期用無塵布擦拭樣本槽和光學(xué)部件。

• 校準：定期進行光學(xué)校準和溫度驗證。

• 避免長時間高負荷運行，以延長設(shè)備壽命。

七、常見問題與解決方案

八、技術(shù)參數(shù)（以LightCycler® 480 II為例）

• 溫控范圍：4°C–99°C

• 升降溫速率：最高4.8°C/秒

• 檢測通道：6色熒光（FAM、HEX、ROX、Cy5等）

• 通量：96孔或384孔（視型號）

• 數(shù)據(jù)輸出：Ct值、熔解曲線、基因分型等

九、總結(jié)

羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀通過高精度溫控和多重?zé)晒鈾z測，為核酸定量分析提供穩(wěn)定可靠的技術(shù)支持。其應(yīng)用范圍廣泛，但實驗結(jié)果的準確性依賴于合理的實驗設(shè)計、規(guī)范操作和定期維護。用戶應(yīng)根據(jù)具體需求選擇合適的檢測模式和耗材，并遵循標準化流程以確保數(shù)據(jù)可靠性。