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小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)使用細(xì)節(jié)詳解
小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)是生命科學(xué)領(lǐng)域研究動(dòng)物模型動(dòng)態(tài)生理病理過(guò)程的重要工具，尤其在腫瘤研究、基因表達(dá)分析、藥物研發(fā)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其使用涉及多環(huán)節(jié)精細(xì)操作與技術(shù)要點(diǎn)，以下從系統(tǒng)組成、操作流程、參數(shù)優(yōu)化、數(shù)據(jù)采集與分析及注意事項(xiàng)等方面展開(kāi)詳細(xì)闡述。
一、系統(tǒng)組成與原理
小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)核心組件包括高靈敏度制冷 CCD 相機(jī)、激發(fā)光源(如氙燈或 LED 光源)、濾光片組、成像暗箱及配套軟件。基于生物發(fā)光(如螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因)或熒光標(biāo)記(如綠色熒光蛋白 GFP 及其衍生物)原理，通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)外源或內(nèi)源光源信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活動(dòng)、基因表達(dá)、腫瘤生長(zhǎng)等過(guò)程的可視化與定量分析。
二、操作流程
(一)動(dòng)物準(zhǔn)備
1. 麻醉與固定：依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)(小鼠、大鼠等)和體型，選擇合適的麻醉方式，如異氟烷吸入麻醉腹腔注射麻醉，確保動(dòng)物在成像過(guò)程中保持靜止且生命體征平穩(wěn)。將麻醉后的動(dòng)物輕柔俯臥或仰臥位放置于恒溫成像臺(tái)上，維持體溫(37℃左右)，減少因低溫導(dǎo)致的代謝變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響。
2. 毛發(fā)處理：若成像部位被毛發(fā)覆蓋，需小心剔除毛發(fā)，可使用專(zhuān)用脫毛劑或電動(dòng)剃毛器，避免損傷皮膚。脫毛后用清水清潔皮膚，防止殘留化學(xué)物質(zhì)干擾成像。
(二)熒光標(biāo)記與底物注射
1. 熒光蛋白表達(dá)：對(duì)于轉(zhuǎn)基因熒光小鼠模型，確認(rèn)熒光蛋白表達(dá)穩(wěn)定且均勻。若需增強(qiáng)信號(hào)，可在實(shí)驗(yàn)前適當(dāng)時(shí)間(依熒光蛋白特性而定，如 GFP 通常無(wú)需提前處理)給予動(dòng)物特定刺激(如誘導(dǎo)基因表達(dá)的藥物)或按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行操作。
2. 外源性熒光染料標(biāo)記：根據(jù)研究目的，通過(guò)尾靜脈、腹腔或局部注射等方式給予熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞、抗體或藥物。精確控制注射劑量與時(shí)間，記錄注射信息，確保實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。例如，量子點(diǎn)標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞注射后需等待足夠時(shí)間使其靶向富集到病變部位。
3. 生物發(fā)光底物注射：若采用生物發(fā)光成像，在成像前合適時(shí)間(一般螢火蟲(chóng)熒光素酶底物 D-luciferin 在小鼠體內(nèi)注射后 5 - 15 分鐘達(dá)到發(fā)光峰值)按體重計(jì)算并注射適量底物，迅速將動(dòng)物轉(zhuǎn)移至成像系統(tǒng)，減少信號(hào)衰減。
(三)儀器參數(shù)設(shè)置
1. 光源調(diào)節(jié)：根據(jù)熒光標(biāo)記的激發(fā)光譜，選擇合適的激發(fā)光源波長(zhǎng)與強(qiáng)度。對(duì)于多色熒光成像，需配備對(duì)應(yīng)的濾光片組合，精確切換激發(fā)與發(fā)射濾光片，以區(qū)分不同熒光信號(hào)。調(diào)整光源亮度時(shí)，避免過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致動(dòng)物組織光毒性損傷或熒光淬滅。
2. 相機(jī)設(shè)置：設(shè)置相機(jī)曝光時(shí)間、增益等參數(shù)。曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致信號(hào)飽和或動(dòng)物移動(dòng)產(chǎn)生偽影，過(guò)短則信號(hào)弱、信噪比低。增益適度調(diào)整可增強(qiáng)弱信號(hào)，但過(guò)高會(huì)引入噪聲。對(duì)于低光照生物發(fā)光成像，可適當(dāng)增加曝光時(shí)間與增益，同時(shí)利用軟件降噪功能。
3. 成像視野與分辨率：根據(jù)動(dòng)物大小與研究部位，調(diào)整成像視野大小，確保目標(biāo)區(qū)域完整包含在視野內(nèi)。通過(guò)調(diào)整鏡頭焦距、光學(xué)放大倍數(shù)等獲得合適空間分辨率，平衡視野范圍與細(xì)節(jié)分辨能力，例如研究全身腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)用較大視野，觀察微小病灶局部變化則需高分辨率。
(四)成像采集
1. 預(yù)掃描與定位：在進(jìn)行正式成像前，可進(jìn)行低分辨率預(yù)掃描，快速確定動(dòng)物大致位置與目標(biāo)區(qū)域，便于精準(zhǔn)調(diào)整動(dòng)物姿態(tài)與成像參數(shù)。利用軟件實(shí)時(shí)預(yù)覽功能，觀察動(dòng)物輪廓與標(biāo)記信號(hào)初步分布，必要時(shí)微調(diào)動(dòng)物位置，保證成像準(zhǔn)確性。
2. 多時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)成像：為監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，如腫瘤生長(zhǎng)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)，設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)成像。合理間隔時(shí)間取決于研究進(jìn)程速度，如藥物分布可能在給藥后幾分鐘至幾小時(shí)快速變化，而腫瘤生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)可間隔數(shù)天至一周。每次成像保持動(dòng)物姿勢(shì)、成像參數(shù)一致，減少人為誤差。
3. 多模態(tài)成像(如有)：部分系統(tǒng)具備 X 光、CT 或 MRI 等多模態(tài)成像功能，結(jié)合光學(xué)成像可獲取更全面信息。先進(jìn)行光學(xué)成像，隨后按需進(jìn)行其他模態(tài)掃描，注意不同模態(tài)間動(dòng)物位置配準(zhǔn)與參數(shù)轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)融合分析。
三、數(shù)據(jù)采集與分析
(一)數(shù)據(jù)采集
成像過(guò)程中，系統(tǒng)軟件實(shí)時(shí)采集光學(xué)信號(hào)并轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像數(shù)據(jù)，記錄每個(gè)像素的光子計(jì)數(shù)或灰度值。對(duì)于熒光成像，分別采集不同通道熒光圖像；生物發(fā)光成像則獲取發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)。同時(shí)記錄動(dòng)物基本信息、實(shí)驗(yàn)操作步驟、成像參數(shù)等元數(shù)據(jù)，便于后續(xù)分析溯源。
(二)圖像處理與定量分析
1. 背景扣除：利用軟件工具扣除背景噪聲，如采用滾動(dòng)球算法、閾值設(shè)定等方法，去除非特異性信號(hào)干擾，突出目標(biāo)區(qū)域信號(hào)。對(duì)于生物發(fā)光圖像，扣除動(dòng)物自體熒光背景；熒光成像則扣除未注射標(biāo)記物的對(duì)照動(dòng)物背景信號(hào)。
2. 信號(hào)定量：在扣除背景后的圖像上，通過(guò)劃定感興趣區(qū)域(ROI)，如腫瘤病灶、特定器官等，軟件自動(dòng)計(jì)算區(qū)域內(nèi)平均熒光強(qiáng)度、總光子數(shù)等定量參數(shù)。對(duì)于生物發(fā)光，還可分析發(fā)光峰值、達(dá)峰時(shí)間、半衰期等動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；熒光成像可比較不同組別或時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化，評(píng)估基因表達(dá)差異、藥物療效等。
3. 數(shù)據(jù)歸一化：為消除個(gè)體差異、注射劑量變異等因素對(duì)結(jié)果影響，常將定量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。如以初始信號(hào)值為基準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)變化值；或以某對(duì)照組平均值為參照，比較實(shí)驗(yàn)組相對(duì)比率，使數(shù)據(jù)更具可比性與統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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