一、背景

大鼠垂體瘤細(xì)胞是由Tashjian AH等在1965年7月從一只7月齡的雌性Wistar-Furth大鼠的垂體腫瘤中分離建立的。GH3細(xì)胞系不是直接來源于GH1細(xì)胞系的克隆，而是從原代培養(yǎng)的GH1細(xì)胞在大鼠身上傳代兩次形成的腫瘤中建立的。上皮樣的GH3細(xì)胞比GH1分泌更高水平的生長激素，也可產(chǎn)生催乳素。對調(diào)控GH3細(xì)胞分泌蛋白類激素的研究表明，氫化可的松可以刺激生長激素的分泌、抑制催乳素的產(chǎn)生。

二、大鼠垂體瘤細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1、大鼠垂體瘤細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,貨號31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸鈉0.11g/L)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）大鼠垂體瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）大鼠垂體瘤細(xì)胞凍存液：90%培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2、大鼠垂體瘤細(xì)胞細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇大鼠垂體瘤細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）大鼠垂體瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）大鼠垂體瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。懸浮細(xì)胞凍存時，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進(jìn)行凍存。

三、應(yīng)用

大鼠垂體瘤細(xì)胞可以用于LncRNA MEG3對垂體瘤細(xì)胞增殖，凋亡及EMT影響及其分子機(jī)制：

探討lncRNA MEG3在垂體瘤中的作用及其機(jī)制。

部分LncRNA MEG3在垂體瘤組織中的表達(dá)目的:檢測lncRNA MEG3在垂體瘤患者中的表達(dá)。

方法：

1、GSE77517從GEO數(shù)據(jù)庫下載。

2、搜集垂體瘤患者腫瘤組織樣本和正常癌旁組織樣本34對,qRT-PCR檢測lncRNA MEG3表達(dá)。

3、qRT-PCR檢測不同分期垂體瘤腫瘤組織中MEG3的表達(dá)。

4、Pearson’sχ2分析MEG3的表達(dá)與垂體瘤患者臨床特征的關(guān)系。

結(jié)果：

1、相較于正常組織,lncRNA MEG3在垂體瘤腫瘤組織中表達(dá)量顯著降低。

2、LncRNA MEG3在Ⅲ-Ⅳ期垂體瘤患者組織中的表達(dá)顯著低于Ⅰ-Ⅱ期垂體瘤患者。

3、LncRNA MEG3的表達(dá)與垂體瘤的侵襲性和臨床等級顯著相關(guān)。

結(jié)論：LncRNA MEG3在垂體瘤患者組織中低表達(dá)并與垂體瘤的侵襲性和臨床等級顯著相關(guān)。

第二部分LncRNA MEG3對大鼠垂體瘤細(xì)胞活性的影響目的:探討LncRNA MEG3對大鼠垂體瘤細(xì)胞活性。

方法：

1、設(shè)計MEG3過表達(dá)序列,在大鼠PA細(xì)胞MMQ和GH3中上調(diào)MEG3的表達(dá)。

2、細(xì)胞增殖通過CCK-8法檢測。

3、流式細(xì)胞儀和蛋白質(zhì)印跡法檢測PA細(xì)胞凋亡。

4、細(xì)胞遷移和侵襲均通過Transwell法檢測。

5、蛋白質(zhì)印跡法檢測EMT相關(guān)因子(E-cadherin,Twist,Slug,MMP-7)的相對蛋白表達(dá)量。

結(jié)果：

1、MEG3表達(dá)的上調(diào)可以抑制PA細(xì)胞GH3和MMQ細(xì)胞增殖能力。

2、MEG3表達(dá)的上調(diào)可以促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞GH3和MMQ細(xì)胞凋亡。

3、MEG3表達(dá)的上調(diào)可以抑制垂體瘤細(xì)胞GH3和MMQ的細(xì)胞增殖,細(xì)胞遷移和侵襲能力。

4、MEG3表達(dá)的上調(diào)可以增加垂體瘤細(xì)胞GH3和MMQ中E-cadherin的表達(dá),并抑制Twist,Slug和MMP-7的表達(dá)。

結(jié)論：LncRNA MEG3的上調(diào)可以促進(jìn)大鼠垂體瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖,遷移,侵襲和EMT。

第三部分 LncRNAMEG3靶向miR-23b-3p/FOXO4目的:探討lncRNAMEG3調(diào)控垂體瘤的分子機(jī)制。

方法：

1、在線生物學(xué)工具預(yù)測MEG3靶向的miRNA。

2、熒光素酶報告實(shí)驗檢測預(yù)測結(jié)果。

3、RNA pull down實(shí)驗檢測預(yù)測結(jié)果。

4、qRT-PCR檢測該miRNA在轉(zhuǎn)染了MEG3/NC后的GH3和MMQ細(xì)胞中的表達(dá)。

5、qRT-PCR檢測該miRNA在垂體瘤組織樣本中的表達(dá)。

6、Spearman’s相關(guān)分析計算垂體瘤組織中miRNA的表達(dá)和MEG3表達(dá)的相關(guān)性。

7、在線生物學(xué)工具預(yù)測miRNA下游的mRNA。

8、熒光素酶報告實(shí)驗驗證該預(yù)測。

9、RNA pull down實(shí)驗檢測預(yù)測結(jié)果。

10、蛋白質(zhì)印跡法和qRT-PCR均被用來轉(zhuǎn)染后的PA細(xì)胞中該基因的表達(dá)。

11、qRT-PCR檢測垂體瘤腫瘤組織中該mRNA的表達(dá)。

12、Spearman’s相關(guān)分析計算MEG3/miR-23b-3p和預(yù)測的mRNA表達(dá)的相關(guān)性。

結(jié)果：

1、LncRNA MEG3靶向miR-23b-3p。

2、在垂體瘤細(xì)胞GH3和MMQ中,上調(diào)MEG3的表達(dá)可以抑制miR-23b-3p的表達(dá)。

3、miR-23b-3p在正常組織中的表達(dá)顯著低于其在垂體瘤組織中的表達(dá)。

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