一、背景

倉鼠肺細胞源自一只雌性中國倉鼠的肺組織，原名V細胞株，1958年Elkind將其改名為V79并用于研究培養(yǎng)中的哺乳動物細胞的X-放射線誘導的損傷及修復。該細胞免疫球蛋白產(chǎn)物和EB病毒表達為陰性。該細胞表達Fas抗原且對TNF和抗-Fas抗體敏感。

二、倉鼠肺細胞培養(yǎng)步驟

1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、倉鼠肺細胞細胞處理：

1）凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面T25瓶為例；

1、細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3、將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

三、應(yīng)用

倉鼠肺細胞可以用于DDT對中國倉鼠肺成纖維細胞（V79）遺傳毒性的研究：

研究DDT對中國倉鼠肺成纖維細胞V79的遺傳毒性。

方法：MTT法測定細胞活性,集落形成試驗檢測細胞增殖,微核實驗測定細胞毒性,染色體畸變分析檢測細胞遺傳損傷。

結(jié)果：與溶劑對照組相比,MTT法結(jié)果顯示,分別處理4h、8h、12h、24h時6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均可降低V79細胞的活性,與10μg/ml CP的作用類似,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。集落形成實驗結(jié)果顯示,處理4h、8h、12h、24h時12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT可抑制V79細胞的增殖,與10μg/ml CP的作用類似具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),具有良好的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。

微核實驗結(jié)果表明,在無體外活化系統(tǒng)S9參與時,DDT各濃度組對V79細胞微核率結(jié)果無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明DDT對V79細胞無明顯DNA損傷,沒有表現(xiàn)出遺傳毒性;添加S9以后,6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均對V79細胞有顯著的遺傳毒性,此結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且在6.25μg/ml、50.00μg/ml劑量時呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,該關(guān)系有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

染色體畸變試驗結(jié)果顯示,在不添加S9時,DDT各濃度組對V79細胞染色體畸變效果無統(tǒng)計學意義(P>0.05),視為對細胞染色體沒有造成損傷,無明顯致畸作用;在有S9系統(tǒng)參與以后,6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均對V79細胞染色體畸變有顯著影響,該影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05),可造成細胞染色體損傷,且在6.25μg/ml、50.00μg/ml劑量時具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

結(jié)論：DDT具有與環(huán)磷酰胺相似的細胞毒性,能夠降低V79細胞的細胞活性,抑制細胞增殖。在體外活化系統(tǒng)S9作用下,DDT可促使V79細胞微核率和染色體畸變發(fā)生率的增加,而無體外活化系統(tǒng)S9時此作用不明顯。其作用機制可能是在細胞有絲分裂的過程中,造成DNA和染色體的損傷,致使染色體發(fā)生突變、斷裂,從而表現(xiàn)出潛在的致畸作用。

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