所謂的油鏡、水鏡，其實(shí)是指物鏡的浸漬介質(zhì)不同。

為了獲得高分辨率，物鏡的數(shù)值孔徑(NA)需要大于1。還需要折射率大于1的浸漬介質(zhì)，即空氣以外的介質(zhì)。常見的浸漬介質(zhì)有油、水和甘油。物鏡上標(biāo)明了必須與該物鏡一起使用的浸漬介質(zhì)。

有些物鏡只能使用對(duì)應(yīng)的一種浸漬介質(zhì)，但也有一些物鏡適用于多種浸漬介質(zhì)。具體涉及到顯微成像的對(duì)應(yīng)要求。其中最重要的考慮參數(shù)是——折射率。

物鏡前透鏡前面的所有光學(xué)相關(guān)元件（浸漬介質(zhì)、蓋玻片、樣本）都會(huì)對(duì)圖像質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。理想狀態(tài)下，所有這些光學(xué)層的折射率都應(yīng)與物鏡設(shè)計(jì)的折射率相匹配。實(shí)際上，這幾乎是不可能的，因?yàn)闃颖就ǔ２痪鶆颍w玻片的厚度不夠精確且圖像采集過程中溫度會(huì)發(fā)生變化。

在為特定應(yīng)用選擇物鏡和浸漬介質(zhì)時(shí)，必須牢記這些因素。

物鏡的數(shù)值孔徑越高，樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，樣本和浸漬介質(zhì)的折射率匹配就越重要。不同的折射率會(huì)導(dǎo)致球差和畸變。這會(huì)導(dǎo)致對(duì)比度和清晰度降低，使結(jié)構(gòu)看起來被壓縮或拉伸。

下表為一些常用浸漬介質(zhì)的折射率

哪些情況適用油鏡（油浸物鏡）？

油浸物鏡適用于與油的折射率相匹的樣本，即通常觀察封在樹脂、加拿大香脂或甘油明膠中的固定樣本，或者在蓋玻片下的樣本（小于幾微米）。如果折射率不匹配，離蓋玻片位置太遠(yuǎn)，圖像亮度和分辨率會(huì)下降。

徠卡N型和F型浸油的折射率為1.518（23℃和546納米條件下），即與標(biāo)準(zhǔn)冕牌玻璃（n=1.518）相同。進(jìn)行多色成像時(shí)，浸油的色散度也很重要。這通常稱為阿貝數(shù)，應(yīng)該與物鏡設(shè)計(jì)的阿貝數(shù)相匹配，否則會(huì)出現(xiàn)色差。例如，徠卡N型浸油的阿貝數(shù)為42.1，而 F 型浸油的阿貝數(shù)為 46，非常適合熒光成像。N型不適合熒光成像。

進(jìn)行活細(xì)胞成像，即在含水樣本中成像時(shí)，我們強(qiáng)烈建議使用水或甘油浸漬。

孔徑非常高的油浸物鏡只能在比較窄的溫度區(qū)間內(nèi)提供其全部光學(xué)性能，因?yàn)橛徒恼凵渎试诤艽蟪潭壬先Q于溫度。自由工作距離越大，油層越厚，因此溫度引起的像差對(duì)圖像質(zhì)量的影響越大。這種溫度效應(yīng)隨自由工作距離線性變化，但取決于 NA 的四次方。

如果實(shí)驗(yàn)溫度與室溫不同，建議采用水浸法，因?yàn)樗恼凵渎蕦?duì)溫度的依賴性明顯較小，而且許多水浸泡物鏡都有校正環(huán)，因此可以補(bǔ)償。

哪些情況適用水鏡（水浸物鏡）？

在研究級(jí)顯微鏡（通常是共聚焦顯微鏡）上有一種不太常見的浸沒式物鏡是“水浸”物鏡，通常在物鏡筒上縮寫為“WI”或“W”。當(dāng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中的活細(xì)胞成像時(shí)，強(qiáng)烈建議使用水浸式物鏡。

水浸物鏡特別適合觀察水介質(zhì)中的活細(xì)胞，因?yàn)檫@種浸漬介質(zhì)和樣本的折射率比浸漬油等介質(zhì)更匹配。然而，水在 37℃ 時(shí)會(huì)迅速蒸發(fā)。徠卡水鏡自動(dòng)加水裝置在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)期間會(huì)自動(dòng)加水，以提供穩(wěn)定的水浸。

水浸式物鏡通常與正置顯微鏡配置一起使用，用于直接浸入水或水基介質(zhì)/緩沖液中。水澆蘸物鏡則可提供很長的工作距離。這種物鏡在生產(chǎn)時(shí)還配有十分曲折的彎角轉(zhuǎn)盤，使用惰性材料如陶瓷等制作而成。水浸物鏡的使用方式與油浸物鏡類似，但要用水代替油。

使用水浸式物鏡的優(yōu)點(diǎn)之一是簡單地將水作為浸沒介質(zhì)。很明顯，這種介質(zhì)很容易清洗。此外，您不需要根據(jù)正在進(jìn)行的成像使用特定的浸沒油，也不需要使用顯微鏡和物鏡制造商指定的浸沒介質(zhì)。但使用水浸式物鏡時(shí)有一些缺點(diǎn)。與水性物鏡相比，油浸物鏡具有更高的分辨率。此外，由于水的粘度（與油相比），使用水浸式物鏡容易受到振動(dòng)和小空氣運(yùn)動(dòng)的影響。

哪些情況試用甘油物鏡？

甘油是另一種浸沒介質(zhì)。很多固定樣本都使用Mowiol、Vectashield或類似的甘油基封片劑封片。這些介質(zhì)的折射率接近于80/20 甘油/水混合溶液的折射率（RI=1.45）。對(duì)于此類封片劑封片標(biāo)本，甘油物鏡是好的選擇。

目前，大多數(shù)固定樣本，如培養(yǎng)細(xì)胞、厚樣本的組織切片以及全胚胎，都封閉在 Mowiol、Vectashield 或類似的 含有水和甘油以及各種化學(xué)物質(zhì)（如防變色和防腐物質(zhì)）的混合物中。這些介質(zhì)的折射率接近 80%/20% 甘油/水混合物的折射率(n=1.45)。甘油物鏡非常適用于封閉在折射率接近 1.45–1.46 的任何介質(zhì)中的樣本。

有的徠卡甘油物鏡會(huì)配有一個(gè)校正環(huán)，用于根據(jù)封閉介質(zhì)成分的變化或者蓋玻片厚度或溫度的變化來調(diào)整光學(xué)元件的折射率。

而大多數(shù)多浸漬 (IMM)物鏡可用于甘油以及水和油浸漬。

常用甘油浸漬的徠卡物鏡型號(hào)：

HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2

HC PL APO 40x/1.25 GLYC CORR CS2

HC PL APO 40x/1.25 GLYC motCORR CS2

HC PL APO 93x/1.30 GLYC motC STED W