百歐博偉生物：1949 年至 1960 年這一段時(shí)間可以稱(chēng)為冷凍保存的“甘油時(shí)期”，這一時(shí)期對(duì)生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護(hù)劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。而且，用于冷凍保存的儀器也有明顯的發(fā)展。目前，無(wú)論是冷凍保存理論、各種保護(hù)劑、冷凍用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已十分成熟和完備。

一、冷凍與復(fù)蘇原理

在低于-700C 的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低， 細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。

這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。

如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱(chēng)為溶質(zhì)損傷或稱(chēng)溶液損傷。

當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。

在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1-2 分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。

冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。

1、冷凍速率

冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-50C 時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5～-150C 之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。

2、冷凍保存溫度

冷凍保存溫度是指能長(zhǎng)期保存細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。不同的細(xì)胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是目前的冷凍保存溫度。在-1960C 時(shí)，細(xì)胞的生命活動(dòng)幾乎停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過(guò)程得當(dāng)，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C～-800C保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點(diǎn)到-400C范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。

3、復(fù)蘇速率

冷凍保護(hù)體外培養(yǎng)物，除了必須有的冷凍速率、合適的冷凍保護(hù)劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時(shí)也必須有的復(fù)溫速率，這樣才能保證最后獲得冷凍保存效果。復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低凍存細(xì)胞存活率。一般來(lái)說(shuō)，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在 370C 水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過(guò)慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時(shí)造成的細(xì)胞損傷非?？?，往往在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。

二、冷凍保存方法

按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來(lái)劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-700C～-800C，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C 以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒(méi)有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存的仍是前一種方法。

1、非玻璃化凍存方法

下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例：

在使用DMSO前，不要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO 對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)帶手套。在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧、以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對(duì)皮膚造成凍傷。操作過(guò)程中帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。

應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無(wú)微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價(jià)值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，要復(fù)蘇1~2 管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí)，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37~400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn)。

2、玻璃化凍存方法

以下以人單核細(xì)胞為例：

玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對(duì)細(xì)胞具有毒性（但在 40C時(shí)毒性大為減弱）。

所以，冷凍保護(hù)液的滴加全過(guò)程必須在 40C 冰浴中進(jìn)行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過(guò)快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時(shí)間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡。

三、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法及注意事項(xiàng)

1、非玻璃化凍存復(fù)蘇方法

主要材料：

(1)儀器設(shè)備:恒溫水浴箱、高速離心機(jī)。

(2)培養(yǎng)用液:培養(yǎng)液。

復(fù)蘇過(guò)程：

(1)調(diào)配370C~ 400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C~400C。

(2)從液氮中取出凍存管，立即投入370C~400C溫水中迅速晃動(dòng)，直至凍存液溶解。

(3)將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。

(4)將細(xì)胞懸液經(jīng)800~ 1000r/min離心5min，棄上清夜。

(5)向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

結(jié)果：

復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá) 90%以上。

注意事項(xiàng)：

細(xì)胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。實(shí)驗(yàn)人員在復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)程中，同樣應(yīng)具有自我保護(hù)意識(shí)，避免被液氮凍傷。

2、玻璃化凍存復(fù)蘇方法

主要材料：

(1)設(shè)備:高速離心機(jī)。

(2)培養(yǎng)用液:添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。

操作過(guò)程：

(1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復(fù)溫速率約5600C/min。一次可以進(jìn)行多個(gè)凍存管的復(fù)蘇。

(2)將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中。

(3)沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。min以0. 2m1/min的速度加入，后10min以0. 5ml/min的速度加入，接著的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全過(guò)程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行。

(4)將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用于培養(yǎng)。

結(jié)果：

復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。

注意事項(xiàng)：

復(fù)蘇時(shí)，冷凍保護(hù)液的稀釋及去除過(guò)程與凍存前冷凍保護(hù)液的滴加過(guò)程一樣，不能在室溫下而必須在40C冰浴中進(jìn)行，避免在室溫下冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。稀釋過(guò)程也要緩慢進(jìn)行，保證有足夠的時(shí)間讓冷凍保護(hù)劑從細(xì)胞內(nèi)滲出，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。

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