樣品處理不當(dāng)會(huì)在多個(gè)方面對(duì)電泳結(jié)果產(chǎn)生影響,具體如下:
條帶形狀異常
拖尾:若樣品濃度過高,會(huì)使蛋白質(zhì)或核酸分子在凝膠中移動(dòng)時(shí)相互干擾,導(dǎo)致條帶拖尾。另外,樣品溶解不充分,存在未溶解的顆粒,也會(huì)造成條帶拖尾,因?yàn)檫@些顆粒會(huì)在電泳過程中不規(guī)則移動(dòng),影響條帶的形狀。
扭曲變形:處理樣品時(shí)若局部受熱或 pH 值不均勻,會(huì)使生物大分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而在電場(chǎng)中的遷移行為異常,導(dǎo)致條帶扭曲變形。例如,在蛋白質(zhì)電泳中,若加入的 SDS 不均勻,會(huì)使蛋白質(zhì)分子結(jié)合的 SDS 量不同,導(dǎo)致其帶電情況和構(gòu)象變化不一致,進(jìn)而使條帶變形。
條帶分辨率降低
樣品未充分分離:如果在樣品處理過程中,沒有使蛋白質(zhì)或核酸充分變性或解聚,那么它們可能會(huì)以多聚體或復(fù)合物的形式存在,在電泳時(shí)無法按照各自的分子量大小進(jìn)行有效分離,使得條帶分辨率降低,相鄰條帶難以區(qū)分。
擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重:樣品處理后若未及時(shí)進(jìn)行電泳,或在電泳過程中樣品槽中的樣品泄漏,都會(huì)導(dǎo)致樣品在凝膠中擴(kuò)散,使條帶變寬,分辨率下降。例如,核酸樣品在加樣前若在室溫下放置時(shí)間過長,其在溶液中的擴(kuò)散會(huì)使加樣后形成的條帶變模糊。
條帶缺失或信號(hào)減弱
樣品降解:在樣品收集、保存或處理過程中,若受到核酸酶、蛋白酶等的作用,會(huì)導(dǎo)致核酸或蛋白質(zhì)降解。例如,在提取 RNA 時(shí),若實(shí)驗(yàn)環(huán)境中存在 RNA 酶,會(huì)使 RNA 被降解,在電泳結(jié)果中表現(xiàn)為條帶缺失或信號(hào)減弱。
樣品損失:在樣品處理的各個(gè)環(huán)節(jié),如轉(zhuǎn)移、離心等過程中,若操作不當(dāng),可能會(huì)導(dǎo)致樣品的丟失。例如,在吸取樣品時(shí),移液器操作不準(zhǔn)確,可能會(huì)少吸取部分樣品,或者在離心過程中,離心管破裂導(dǎo)致樣品損失,最終使電泳條帶信號(hào)減弱甚至缺失。
非特異性條帶出現(xiàn)
雜質(zhì)干擾:處理樣品時(shí),如果混入了其他雜質(zhì),如在細(xì)胞裂解過程中未去除干凈的細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基成分等,這些雜質(zhì)可能會(huì)在電泳過程中與目標(biāo)生物大分子一起遷移,形成非特異性條帶,干擾對(duì)結(jié)果的分析。
化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生異常產(chǎn)物:樣品處理過程中,若發(fā)生了一些非預(yù)期的化學(xué)反應(yīng),如蛋白質(zhì)的氧化、糖基化等,可能會(huì)產(chǎn)生一些修飾后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,它們?cè)陔娪局袝?huì)形成額外的條帶,影響對(duì)正常條帶的判斷。