pcr實(shí)驗(yàn)原理：

    qPCR基于傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，通過逐漸擴(kuò)增目標(biāo)DNA或cDNA的數(shù)量使其可檢測(cè)。與傳統(tǒng)PCR不同的是，qPCR在擴(kuò)增過程中同時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

    qPCR的原理基于熒光探針（例如TaqMan探針或SYBR Green I染料）。這些探針通過與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合，在PCR過程中釋放熒光信號(hào)。

    SYBR Green I：該染料能與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生新的雙鏈DNA時(shí)，SYBR Green I與其結(jié)合并發(fā)出熒光信號(hào)。

    TaqMan探針：該探針由引物和熒光探針組成，熒光探針含有一個(gè)熒光染料和一個(gè)熒光猝滅劑。在PCR擴(kuò)增過程中，熒光探針通過引物特異性結(jié)合到目標(biāo)序列上，并且Taqpolymerase酵素的核酸酶活性會(huì)切除掉熒光探針上的猝滅劑，導(dǎo)致熒光染料釋放出信號(hào)。

PCR擴(kuò)增中避免非特異性產(chǎn)物的綜合策略

一、優(yōu)化引物設(shè)計(jì)

提高引物特異性

確保引物與目標(biāo)序列高度匹配，避開非目標(biāo)區(qū)域的相似序列（如通過BLAST比對(duì)驗(yàn)證）；

引物長(zhǎng)度控制在18-24 bp，GC含量40–60%，避免引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

減少引物濃度

過高引物濃度易引發(fā)非特異性結(jié)合或引物二聚體，建議調(diào)整至0.1–0.5 μM。

二、調(diào)控PCR反應(yīng)條件

調(diào)整退火溫度

適當(dāng)提高退火溫度?（接近引物Tm值±2℃），增強(qiáng)引物與模板結(jié)合的嚴(yán)謹(jǐn)性，減少非特異性結(jié)合。

優(yōu)化Mg2?濃度

Mg2?濃度過高（＞2.5 mM）會(huì)降低反應(yīng)特異性，需通過梯度實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度（通常1.5–2.5 mM）。

縮短延伸時(shí)間與循環(huán)次數(shù)?

延伸時(shí)間按產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)定（1 kb/min），避免過度延伸導(dǎo)致副產(chǎn)物積累；

減少循環(huán)次數(shù)（通常25–35次），防止非特異性產(chǎn)物指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

使用熱啟動(dòng)Taq酶

熱啟動(dòng)聚合酶在低溫下無(wú)活性，可抑制早期非特異性擴(kuò)增。

三、防污染操作

分區(qū)操作?

實(shí)驗(yàn)區(qū)域分為樣本處理區(qū)、試劑配制區(qū)及擴(kuò)增區(qū)，避免氣溶膠污染。

使用UNG酶

添加尿嘧啶糖基化酶（UNG）降解含dU的污染產(chǎn)物，抑制殘留DNA擴(kuò)增。

設(shè)置陰性對(duì)照

加入無(wú)模板對(duì)照（NTC）以監(jiān)測(cè)試劑或環(huán)境污染物。

四、模板與試劑優(yōu)化

純化模板DNA

模板降解或雜質(zhì)（如多糖、蛋白）可能引發(fā)非特異性擴(kuò)增，需通過電泳或純化試劑盒驗(yàn)證完整性。

調(diào)整模板用量

過高模板量會(huì)增加非特異性結(jié)合的幾率，建議按實(shí)驗(yàn)體系推薦量添加（通常1–100 ng）。

五、其他輔助策略

使用降落PCR（Touchdown PCR）

初始退火溫度高于Tm值并逐漸降低，優(yōu)先擴(kuò)增高特異性產(chǎn)物45。

添加增強(qiáng)劑?

DMSO（5–10%）、甜菜堿（1–1.5 M）等可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)干擾，提升特異性。

巢式PCR

分兩輪擴(kuò)增，使用外側(cè)和內(nèi)側(cè)兩對(duì)引物，降低背景干擾