細胞凋亡檢測

細胞凋亡作為程序性死亡的核心形式，在發(fā)育調控、疾病機制(如癌癥、免疫缺陷)及藥物研發(fā)中具有重要研究價值。針對其復雜動態(tài)過程，現有檢測方法大致可分為基于細胞形態(tài)、生物學功能和生化標記三大類。

本文將系統(tǒng)梳理常用方法的實驗原理與實驗步驟，并結合典型產品推薦，為研究者提供參考。

01

基于細胞形態(tài)

1.1 電鏡分析

透射電子顯微鏡 (TEM) 被認為是檢測細胞凋亡的金標準。

細胞凋亡的主要特征是：(1) 電子致密核 (早期邊緣化)；(2) 核碎裂；(3) 完整的細胞膜；(4) 雜亂無章的細胞質、 細胞器；(5) 大而透明的空泡；(6) 細胞表面有氣泡。

如 Figure 4 所示，TEM 顯示 BBR (小檗堿) 或 DDP (順鉑) 誘導大量 OVCAR3 細胞凋亡。變化主要包括細胞 質皺縮、質膜起泡、染色質濃縮和凋亡小體形成。透射電鏡的主要缺點是成本高，一次只能檢測一小塊區(qū)域，難以及早發(fā)現凋亡細胞[1][5]。

Figure 4. TEM 檢測小檗堿 (BBR) (100 μΜ) 和順鉑 (DDP) (5 μg/mL) 誘導 OVCAR3 細胞 24 h 后的細胞凋亡形態(tài)[5]。

1.2 細胞核染色分析

在凋亡細胞中，質膜通透性和染色質濃縮發(fā)生變化，可以使用 DAPI、Hoechst 以及碘化丙啶 (PI) 熒光染料， 通過流式細胞儀或熒光顯微鏡輕松檢測到。

Figure 5. DAPI, Hoechst 和 PI 的熒光染色效果圖[6][7]。

(A) 甲基乙二醛(MG)(1.5 mM, 24 h)誘導PC12細胞凋亡，并用PI和Hoechst 33342染色。

(B) DAPI(藍色)和TUNEL(綠色)染色凋亡的MODE-K細胞。

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02

基于生物學功能

2.1 Annexin V/PI 雙染法

Annexin V 屬于 Ca2+-依賴性磷脂結合蛋白，可特異性粘附細胞膜上的磷脂酰絲氨酸 (PS)。在健康細胞中， PS 位于質膜的胞質側，但在凋亡早期轉移至細胞膜外。因此，熒光標記 (如 FITC、EGFP 標記) 的 Annexin V 可用于檢測細胞凋亡早期細胞膜胞外側 PS 的存在。PI 一般可與 Annexin V 結合以區(qū)分凋亡和壞死細胞，可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測[8]。

Figure 6. DAPI, Annexin V-FITC 和 PI 共染的代表性圖像，顯示 Bufalin (100 nM, 48 h) 誘導 HepG2 細胞凋亡[9]。(A) 共聚焦圖像, (B) 流式細胞術分析。

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Annexin V/PI 雙染法參考[9]：

1. 對于懸浮細胞: 1000 ×g 離心 5 分鐘，棄上清。加入 1 mL 預冷的 PBS 輕輕重懸, 1000 ×g 離心 5 分鐘， 棄上清。 對于貼壁細胞: 用 PBS 清洗細胞并加入胰蛋白酶 (不含 EDTA) 以分離細胞。添加新鮮培養(yǎng)基并輕輕懸浮細胞 制成單細胞懸浮液。1000 ×g 離心 5 分鐘，然后棄去上清液。加入 1 mL 預冷的 PBS 重懸細胞沉淀，1000 ×g 離心 5 分鐘棄上清，保留細胞沉淀。

2. 將細胞重新懸浮于 195 μL Binding Buffer 中。 加入 5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI (Propidium Iodide)，室溫避光 孵育 10-20 min。孵育過程中可輕輕顛倒數次 ，以加強染色效果。

3. 檢測與分析

(1) 流式細胞儀檢測: Annexin V-FITC (Ex=488 nm; Em=525 nm) 綠色熒光，在 FL1 通道檢測；

PI-DNA (Ex=535 nm; Em=617 nm) 紅色熒光，在 FL2 或 FL3 通道檢測?；罴毎尸F為 Annexin V? /PI?陰性， 早期凋亡細胞為 Annexin V+ /PI? ，而晚期凋亡細胞為 Annexin V+ /PI+ 。

(2) 熒光顯微鏡檢測: 1000 ×g 離心 5 分鐘，棄去上清，加入 50-100 μL Binding Buffer 輕輕重懸細胞沉淀，涂片后用熒光顯微鏡檢測熒光強度。

2.2 線粒體膜電位檢測

細胞凋亡被認為與線粒體通透性孔的開放和電化學梯度的喪失有關，線粒體跨膜電位 (?ΨM) 的下降是細胞凋亡 的標志，可用于早期細胞凋亡檢測。 JC-1 染料是一種親脂性陽離子染料，廣泛用于檢測多種細胞類型的 ?ΨM 變化。其原理為: 在具有較高 ?ΨM 的健康細胞中，JC-1 染料可進入細胞并在線粒體中積累，形成 J-aggregates (Ex/Em=585/590 nm, 橙紅色熒光)。在凋亡細胞中，?ΨM 較低，JC-1 染料進入線粒體較少，以單體形式存在 (Ex/Em=510/527 nm, 綠色熒光)。

因此，通過熒光顯微鏡或流式細胞術檢測 JC-1 的紅/綠熒光比值可用于評估細胞凋亡狀態(tài)[10]。

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JC-1 染色參考[11]：

懸浮細胞

1. 以 6 孔板為例，每孔用 1 mL 培養(yǎng)基重懸 100 萬細胞，并根據實驗處理細胞。

2. 細胞染色

(1) 陽性對照：取適量CCCP (50 mM)恢復至室溫，在陽性對照孔中加入1 μL (終濃度為50 μM)，37℃孵育5 分鐘 。

(2) 實驗組：取適量 JC-1 (200 μM) 恢復至室溫，每孔加入 10 μL (終濃度為 2 μM)。37°C，避光孵育 15-20 分鐘。

3. 孵育結束后，400 ×g 4℃ 離心 3-4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。

4. 用 PBS (1×) 洗滌 2 次：加入 2 mL PBS (1×) 重懸細胞，400 ×g 4℃ 離心 3-4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。

5. 用 500 μL 的 PBS (1×) 重懸細胞。

6. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計或流式細胞儀分析 (JC-1 單體呈現綠色熒光： Ex/Em=510/527 nm；JC-1 聚集體呈現紅色熒光：Ex/Em=585/590 nm)。

貼壁細胞

1. 若用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測貼壁細胞，可先對貼壁細胞進行消化、收集，重懸后參考懸浮細胞的 檢測方法。

2. 若用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測，JC-1 染色完成后棄上清，用 PBS (1x) 洗滌 2 次，加入 500 μL PBS (1x)，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察即可。

Figure 7. Ang/TAT-sgGSS-EVs 處理膠質母細胞瘤細胞48h 后，通過 JC-1 (HY-15534) 檢測線粒體膜電位變化 (顯著下降)[12]。

結果顯示，經 Ang/TAT-sgGSS-EVs 處理后，線粒體膜電位 MMP (?φM) 顯著降低，具體表現為綠/紅熒光比值 增加。表明 Ang/TAT-sgGSS-EVs 有效地破壞了靶基因并加劇了放射治療 (RT) 引起的鐵死亡。

03

基于生物學功能

3.1 凋亡相關標志物檢測

如前所述，細胞凋亡途徑最終均導致 Caspase-3 的切割和激活。因此，可以通過 Caspase-3 來對晚期細胞 凋亡進行檢測。此外，細胞凋亡的其他生物標志物還包括活化的 Caspases 2/7/8/9, Cytochrome c, Bcl-2/Bcl-xl/Mcl-1, PARP 等。這些生物標志物可以通過多種方式檢測，包括免疫印跡、免疫沉淀和免疫組化[13]。

Figure 8. Infliximab (10 μg/mL, 24/48 h) 而非Etanercept (10 μg/mL, 24/48 h)

激活淋巴細胞中的 Caspase 3 (通過Western blot檢測)[14]。

熱銷凋亡相關檢測抗體

Caspase 3 分析試劑盒 VF 488 Caspase 3 活細胞分析試劑盒 (HY-K1088

3.2 DNA 片段檢測

3.2.1 DNA 階梯技術

在凋亡細胞中，DNA 被核酸內切酶切割，細胞凋亡的后期會發(fā)生 DNA 片段化。從而導致了一個特征性的“DNA 階梯”(在瓊脂糖凝膠上顯現)，階梯中的每個條帶大小相隔大約 180 個堿基對。因此，可通過 DNA 階梯技術來 進行檢測[1]。

Figure 9. 暴露于 DNA 損傷條件 (UV, Etoposide 30 μM, γ 100 Gy) 下， Jurkat 細胞中的 DNA 片段化[15]。

3.2.2 TUNEL 染色法

TUNEL 染色法的原理是：片段化的 DNA 末端產生游離的 3’-OH 基團。熒光探針標記的 Dutp 可通過末端 脫氧核苷酸轉移酶 (TdT) 添加到暴露的 3'-OH 基團上，從而使 DNA 片段產生熒光，可通過熒光顯微鏡或者 流式細胞儀來檢測[16]。

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TUNEL 染色法參考 (HY-K1079 為例)：

1. 懸浮細胞樣品處理

(1) 洗滌：離心收集細胞 (不超過 2×106 個細胞)，加入 PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。

(2) 固定：加入固定液 4℃ 固定 30 分鐘。建議置于搖床上固定，以防止細胞聚團。

(3) 洗滌：加入 PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。輕輕棄去 PBS，并用濾紙吸去多余的液體。

(4) 通透：加入通透液室溫孵育 5 分鐘。

(5) 洗滌：加入 PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。輕輕棄去 PBS，并用濾紙吸去多余的液體。

注：貼壁細胞/石蠟切片/冰凍切片樣品處理方法見 MCE 產品說明書。

2. 標記與檢測

(1) 加入 50 μL TUNEL 工作液，37℃ 避光孵育 1 小時。

(2) 加入 PBS 洗滌 3 次。加入 250-500 μL PBS 充分懸浮細胞。

(3) 用流式細胞儀檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。Cy3 (Ex=550 nm; Em=570 nm) 染色后，凋亡細胞顯示 紅色熒光 (用 HY-K1078 則凋亡細胞呈綠色熒光)，正常細胞無熒光。

注：若 TUNEL 反應過強，可用 TdT Dilution Buffer 將 TdT Enzyme 稀釋 2-5 倍后再進行操作。

Figure 10. 高滲 500 mOsm 培養(yǎng)基中角膜上皮細胞死亡增加，SP600125 (20 μM, 24 h) 顯著減少細胞死亡 (通過 TUNEL 染色確定) [17]。

無論是基礎研究或藥物開發(fā)，精準檢測細胞凋亡是關鍵。形態(tài)學方法驗證結構變化，功能學工具（如膜電位檢測）揭示機制，生化標記（如TUNEL）量化結果。MCE多款明星產品（如Annexin V-FITC試劑盒、Caspase-3抗體）適配不同場景，助您高效獲取高質量數據。

04

參考文獻

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[12] ACS Nano. 2023 Sep 12;17(17):16432-16447.

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