發(fā)光細(xì)菌（luminescent bacteria.luminousbacteria），進(jìn)行生物發(fā)光的細(xì)菌。多數(shù)為海生，與發(fā)光浮游生物同是引起海面發(fā)光的原因。此外，在空氣中，死魚及水產(chǎn)加工食品的表面于暗處也會發(fā)光，這種發(fā)光現(xiàn)象是海生菌第二次生長繁殖的結(jié)果。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白胨培養(yǎng)基可以培養(yǎng)。

一、知識介紹

發(fā)光細(xì)菌 luminescent bacteria.luminousbacteria，進(jìn)行生物發(fā)光的細(xì)菌。多數(shù)為海生，與發(fā)光浮游生物同能引起海面發(fā)光。此外，在空氣中，死魚及水產(chǎn)加工食品的表面于暗處也會發(fā)光，這種發(fā)光現(xiàn)象導(dǎo)致海生菌的第二次生長繁殖。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白胨培養(yǎng)基可以培養(yǎng)。發(fā)光菌形態(tài)雖多種多樣，但生理特性卻非常相似。一般對明膠不產(chǎn)生液化，分解蛋白質(zhì)后不形成毒物，常寄生在各種動(dòng)物體上引起“發(fā)光病”，即寄生發(fā)光。這些細(xì)菌通常經(jīng)由寄主的卵傳遞給后代寄主。有些發(fā)光魚類和烏賊是和發(fā)光細(xì)菌共生而利用了細(xì)菌的發(fā)光。明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛馬的死尸和肉中繁殖；它侵入人體則會產(chǎn)生發(fā)光尿。這些細(xì)菌一般好低溫，溫度約為18℃，37℃以上則不發(fā)光。發(fā)光現(xiàn)象是酶促氧化反應(yīng)，必需FM－NH2，O2長鏈飽和醛，蟲熒光素酶等。一般認(rèn)為FMNH2就是熒光素。發(fā)光細(xì)菌有一百幾十種，除上述幾種外，典型的還有魚無色桿菌（Achromobac-ter fisheri）、磷光弧菌（Vibrio phosphoresce－ns）、發(fā)光桿菌（Bacillus photogenus）等。細(xì)菌發(fā)光的生物學(xué)意義與動(dòng)物發(fā)光不同，還不十分清楚。根據(jù)具有可以抑制氯高鐵血紅素呼吸濃度的一氧化碳，而不能抑制其氧化過程這點(diǎn)來看，可以把它看作是不參與細(xì)胞色素系統(tǒng)的呼吸形式稱為發(fā)光呼吸。發(fā)光細(xì)菌發(fā)出青白色光，如魚無色桿菌所發(fā)出的光，波長為490納米。

目前國內(nèi)常用的3種發(fā)光細(xì)菌為：明亮發(fā)光桿菌、費(fèi)氏弧菌、青?；【?/span>

其中以明亮發(fā)光桿菌在 GB/T15441-1995 水質(zhì) 急性毒性的測定 發(fā)光細(xì)菌法中所使用；

費(fèi)氏弧菌在歐盟的標(biāo)準(zhǔn)中所使用；青?；【窃谇嗪：聂~體內(nèi)提取的菌種，屬淡水菌，在測試飲用水時(shí)有較大優(yōu)勢，并已申請凍干粉制作：ZL 97106203.X

該檢測方法在5.12汶川地震災(zāi)區(qū)有了較大規(guī)模的應(yīng)用，快速、便捷、綜合評價(jià)等優(yōu)點(diǎn)得到了充分發(fā)揮，受到了衛(wèi)生、環(huán)保、疾控部門的重視，國家也將其列入應(yīng)急監(jiān)測項(xiàng)目。能夠提供此類設(shè)備的公司有北京濱松光子技術(shù)股份有限公司（國產(chǎn)技術(shù)）、荷蘭microLAN公司、美國SDI公司、以色列checklight公司等，詳細(xì)信息在其各自網(wǎng)站會有公布。

《發(fā)光細(xì)菌與環(huán)境毒性檢測》一書由朱文杰、鄭天凌、李偉民三位老師完成的作品，內(nèi)容主要介紹了發(fā)光細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用領(lǐng)域等信息，著重介紹了青?；【陌l(fā)展過程，大家感興趣的話可以進(jìn)行查閱！

二、菌種分類

發(fā)光細(xì)菌是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見熒光的細(xì)菌，這種可見熒光波長在450-490nm之間，在黑暗處肉眼可見。已命名的發(fā)光細(xì)菌有以下幾種：① 屬于異短桿菌屬（Xenorhabdus）的有發(fā)光異短桿菌（Xenorhabdus luminescens）；② 屬于發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）的有明亮發(fā)光桿菌（Photosbacterium phosphoreum）和鰒發(fā)光桿菌（P．1eiognathi）；③ 屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）的有羽田希瓦氏菌（Shezoanella hanedai），以前也曾經(jīng)把它歸類為交替單胞菌屬（Alteromonas）的海氏交替單胞菌（Alteromonas hanedia）；④ 屬于弧菌屬（Vibrio）的有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、美麗弧菌生物型I(V．splendidus biotype I）、費(fèi)氏弧菌（V．fischeri）、火神弧菌（V．1ogei）和東方弧菌（V．orientalis）?；魜y弧菌（V．cholerae）和地中?；【╒．mediterranei）中的某些菌株有發(fā)光現(xiàn)象，曾有報(bào)道易北河弧菌（V．a(chǎn)lbensis）有發(fā)光現(xiàn)象，后將其重新分類歸入霍亂弧菌（V．cholerae）。另外，中國學(xué)者分離到一株淡水發(fā)光細(xì)菌命名為青?；【╒. qinhaiensis），還沒收入伯杰氏細(xì)菌手冊。

在以上發(fā)光細(xì)菌中，異短桿菌和青?；【鷮儆诘l(fā)光細(xì)菌，其它都是海洋細(xì)菌。發(fā)光細(xì)菌主要分布于海洋環(huán)境中。

三、發(fā)光機(jī)理

發(fā)光機(jī)理的研究表明，不同種類的發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理是相同的，是由特異性的熒光酶（LE）、還原性的黃素（FMNH2）、八碳以上長鏈脂肪醛（RCHO）、氧分子（O2）所參與的復(fù)雜反應(yīng)，大致歷程如下：

FM NH2+LE → FMNH2·LE+ O2 → LE·FM NH2·O2

+ RCH O →LE·FMNH2·O2·RCH0 → LE+ FM N +H2O+RCOOH+光

概括的說就是，細(xì)菌生物發(fā)光反應(yīng)是由分子氧作用，胞內(nèi)熒光酶催化，將還原態(tài)的黃素單核苷酸（FMNH2）及長鏈脂肪醛氧化為FMN 及長鏈脂肪酸氧化，同時(shí)釋放出發(fā)光強(qiáng)度在波長為450-490nm處的藍(lán)綠光。其中三步反應(yīng)產(chǎn)生三種中間產(chǎn)物，壽命極短，很難分離出來。

熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，細(xì)菌熒光素酶是含α、β兩個(gè)多肽亞基的單加氧酶，只有兩個(gè)亞基共存時(shí)才有活性。從不同海洋細(xì)菌中提取到的細(xì)菌熒光素酶其分子量差別較小。王安平等分離純化了東方弧菌的熒光酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，分離得到了兩個(gè)分子量分別為44 kD和41 kD的亞基，該酶反應(yīng)的溫度在l8℃ ，超過25℃酶即迅速失活。

四、應(yīng)用分類

1、環(huán)境監(jiān)測

發(fā)光細(xì)菌由于其的生理特性，在環(huán)境監(jiān)測中被作為測定環(huán)境中毒物的指標(biāo)。發(fā)光細(xì)菌在正常的生理?xiàng)l件下能發(fā)出波長在450～490nm 的藍(lán)綠色可見光，在一定的試驗(yàn)條件下發(fā)光強(qiáng)度是恒定的。與外來受試物接觸后，由于毒物具有抑制發(fā)光的作用，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度即有所改變，變化的程度與受試物的濃度在一定范圍內(nèi)呈相關(guān)關(guān)系，同時(shí)與該物質(zhì)的毒性大小有關(guān)。外來受試物主要通過下面兩個(gè)途徑抑制細(xì)菌發(fā)光：① 直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶類活性；②抑制細(xì)胞內(nèi)與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的代謝過程。凡能夠干擾或破壞發(fā)光細(xì)菌呼吸、生長、新陳代謝等生理過程的任何有毒物質(zhì)都可以根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度的變化來測定。利用發(fā)光細(xì)菌來檢測有毒物質(zhì)，由于有毒物質(zhì)僅干擾發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光系統(tǒng)，發(fā)光強(qiáng)度的變化可以用發(fā)光光度計(jì)測出，費(fèi)時(shí)較少且靈敏度高，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，所以利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度作為指標(biāo)來監(jiān)測有毒物質(zhì)，在國內(nèi)外越來越受到重視，在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用也越來越廣泛。

利用發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)檢測環(huán)境污染物急性毒性備受重視，中國于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T15441—1995）。相信這一技術(shù)會在中國的環(huán)保事業(yè)中發(fā)揮更大的作用。

2、生物傳感器

利用發(fā)光細(xì)菌制作生物傳感器，是人們研究的熱點(diǎn)之一。發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與某些污染物的濃度呈較好的線性關(guān)系，能夠穩(wěn)定、靈敏、快速地反映環(huán)境中污染物的濃度變化，因此，利用發(fā)光細(xì)菌制備識別元件，成為國內(nèi)外傳感器研究和發(fā)展的熱點(diǎn)。20世紀(jì)80年代初美國Beckman公司推出功能完備的生物毒性測試儀，它具有應(yīng)用范圍廣，靈敏度高，相關(guān)性好，反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)光細(xì)菌毒性測試（Luminescent bacteria toxicitytest，L．B．T．）技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速推廣。細(xì)菌能夠穩(wěn)定、高效、持續(xù)發(fā)光是其被用做生物敏感材料來制備識別元件的基礎(chǔ)，因此篩選優(yōu)良的菌種是傳感器制作的關(guān)鍵之一。海洋發(fā)光細(xì)菌是海洋環(huán)境中的正常微生物，從海洋環(huán)境中分離優(yōu)良的發(fā)光細(xì)菌菌株是可行的。

3、基因組成

發(fā)光基因（lux gene）系統(tǒng)中包括結(jié)構(gòu)基因luxC，D，A，B，E 和調(diào)節(jié)基因luxI和luxR 等。從不同發(fā)光細(xì)菌中分離得到的發(fā)光基因其種類和數(shù)量有所差異，例如luxF僅發(fā)現(xiàn)于明亮發(fā)光桿菌，但以上五個(gè)結(jié)構(gòu)基因luxC，D，A，B，E 是普遍存在于已知的所有發(fā)光細(xì)菌中的。編碼菌熒光素酶的基因是luxA 和luxB，在lux操縱子中，luxA 和luxB 是緊密相連的。以哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）為例，其luxA 基因中含有1065bp，編碼的α亞基是355個(gè)氨基酸的多肽，分子量為40kD；luxB基因中含有972bp，編碼的β亞基是有324個(gè)氨基酸的多肽，分子量為36kD。由α、β兩亞基組成的熒光酶的分子量為76 kD。編碼脂肪酸還原酶(多肽轉(zhuǎn)移酶和還原酶）的luxC和luxD位于luxA、luxB基因的上游一側(cè)，編碼合成酶的luxE基因位于luxA，luxB基因的下游一側(cè)。luxC 含有1431bp，編碼的蛋白質(zhì)含有477個(gè)氨基酸，分子量為55 kD；luxD 編碼的蛋白質(zhì)分子量為33 kD；luxE編碼的蛋白質(zhì)分子量為42 kD。在明亮發(fā)光桿菌中還發(fā)現(xiàn)有l(wèi)uxF基因，它通常位于luxB和luxE之間，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為26 kD 左右，但lux F基因在弧菌屬和異短桿菌屬中的發(fā)光基因系統(tǒng)中尚未被發(fā)現(xiàn)。在以上所有菌株的操縱子中，這些基因的順序都相同，均為lux CDAB(F)E。

在lux 系統(tǒng)中，結(jié)構(gòu)基因上游有2個(gè)調(diào)節(jié)基因，它們是lux I和luxR。它們分別屬于兩個(gè)不同的操縱子之中，lux I在右面的操縱子中，右面的操縱子中還含有l(wèi)ux CDAB(F)E基因，lux I位于lux C 的上游。lux 系統(tǒng)的整個(gè)結(jié)構(gòu)如下：luxR，lux DAB(F)E。lux I編碼的是發(fā)光細(xì)菌自誘導(dǎo)物（autoinducer）因子合成酶，luxR 編碼的是發(fā)光系統(tǒng)的調(diào)節(jié)蛋白。研究表明，luxI和luxR基因的表達(dá)產(chǎn)物都是lux 系統(tǒng)完整表達(dá)并產(chǎn)生發(fā)光的調(diào)節(jié)物質(zhì)，任何一個(gè)基因的有效突變都會改變lux系統(tǒng)的表達(dá)水平，甚至使發(fā)光細(xì)菌變?yōu)榘底兎N。

五、發(fā)光基因特性

發(fā)光細(xì)菌所含的發(fā)光基因（lux gene）表達(dá)的直接結(jié)果是產(chǎn)生生物發(fā)光，非常直觀而且易于檢測，因而被廣泛應(yīng)用于基因操作，作為標(biāo)記（marker）基因和報(bào)告（reporter）基因來研究基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)和調(diào)控。另外，通過基因工程而產(chǎn)生的很多基因工程發(fā)光細(xì)菌的研究和應(yīng)用也很有價(jià)值。完整的發(fā)光基因系統(tǒng)已經(jīng)被成功地轉(zhuǎn)入其他細(xì)胞中，如原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。lux基因可以作為一個(gè)很好的標(biāo)記基因重組在質(zhì)粒載體或其他載體上。若將發(fā)光基因系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)基因放在一個(gè)被試的啟動(dòng)子的下游，一并插入載體DNA中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，可通過宿主細(xì)胞是否發(fā)光確定轉(zhuǎn)導(dǎo)是否成功，并通過宿主細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度的高低來確定發(fā)光基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子的活性大小。另外，還可以用發(fā)光基因來研究終止子（terminator）的活性大小，以及研究其他細(xì)胞內(nèi)的某些基因的表達(dá)與調(diào)控的規(guī)律。利用含有l(wèi)ux系統(tǒng)的具有感染力的載體（噬菌體）在感染宿主細(xì)胞時(shí)能產(chǎn)生生物發(fā)光的現(xiàn)象，可以研究其感染的過程和機(jī)理。

六、具體應(yīng)用

基因工程發(fā)光細(xì)菌是指通過基因工程技術(shù)將lux系統(tǒng)導(dǎo)入其他非發(fā)光宿主細(xì)胞后，形成一類能夠發(fā)光的細(xì)菌。利用基因工程發(fā)光細(xì)菌可以快速測定化學(xué)物質(zhì)及環(huán)境污染物的毒性，確定生物的存活能力，快速確定環(huán)境污染的程度以及進(jìn)行環(huán)境質(zhì)量的評價(jià)。還可以利用基因工程發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌在土壤和水體中分布的研究等。

lux 基因作為報(bào)告基因，用其構(gòu)建基因工程微生物，通過對光線的檢測可以對微生物在環(huán)境中的生長、分布、活性等進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測。如利用發(fā)光酶基因標(biāo)記的熒光假單胞菌檢測在小麥根圈的定植動(dòng)態(tài)；跟蹤棉花根圈中的綠針假單胞菌；用發(fā)光酶基因標(biāo)記巨大芽孢桿菌，獲得穩(wěn)定發(fā)光的標(biāo)記菌株，用于研究其在小麥根際的定殖動(dòng)態(tài)和散布規(guī)律等。

某些細(xì)菌長期生活在含有某種化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境中，細(xì)菌基因組中含有對該物質(zhì)具有特異性的誘導(dǎo)基因和降解基因，或具有對該物質(zhì)的抗性基因。將這些基因與lux基因融合構(gòu)成重組體，在特異的化學(xué)物質(zhì)存在時(shí)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，啟動(dòng)誘導(dǎo)基因并導(dǎo)致lux基因表達(dá)，而由重組體的發(fā)光與否就可得知某化學(xué)物質(zhì)是否存在。研究者們利用細(xì)菌對汞的抗性是依賴于Hg 與merR（汞抗性基因的調(diào)節(jié)基因）基因產(chǎn)物的結(jié)合和表達(dá)激活的原理，構(gòu)建了由merR基因和luxAB基因融合的質(zhì)粒載體，建立了發(fā)光強(qiáng)度與汞含量的關(guān)系。該系統(tǒng)靈敏度高而且專一性很強(qiáng)，用這種方法可檢測出環(huán)境中納克級的汞。因此，利用這種物質(zhì)依賴性的基因工程發(fā)光細(xì)菌在這種特異性物質(zhì)的存在條件下高水平的表達(dá)出生物發(fā)光，且發(fā)光強(qiáng)度與該物質(zhì)的劑量呈正相關(guān)的特點(diǎn)，可以檢測環(huán)境中該物質(zhì)的存在量。已經(jīng)構(gòu)建了汞、砷、苯、萘等物質(zhì)依賴性的基因工程發(fā)光菌，用于環(huán)境中此類物質(zhì)的檢測。發(fā)光細(xì)菌經(jīng)過各種理化方法誘變處理后失去發(fā)光的能力，成為暗變異株。在接觸致突變物后，暗變異株可恢復(fù)一定的發(fā)光能力（通常可使暗變異株的發(fā)光強(qiáng)度增加1000倍左右）。利用暗變異株恢復(fù)發(fā)光的現(xiàn)象，可對各種遺傳毒物進(jìn)行篩選、檢測。此法與其他微生物學(xué)方法（如Ames試驗(yàn)）相比有靈敏、簡便、快速、無需嚴(yán)格無菌操作等特點(diǎn)。已開發(fā)了“Mutatox”的檢測系統(tǒng)，這是繼發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢測的“microtox”之后推出的又一項(xiàng)發(fā)光細(xì)菌檢測技術(shù)。

另外，將lux系統(tǒng)導(dǎo)人某種噬菌體的DNA中，利用噬菌體與其宿主菌之間嚴(yán)格的特異性，可以檢測宿主菌的分布、數(shù)量以及活性，靈敏度高而且速度很快，為環(huán)境微生物檢測提供了一種靈敏有效的方法。

七、方法介紹

水污染問題日益嚴(yán)重，與此同時(shí)也開發(fā)出許多靈敏、有效的環(huán)境監(jiān)測方法，這些方法可以劃分為兩類：分析技術(shù)和生物監(jiān)測。其中分析技術(shù)常常用于廢水常規(guī)指標(biāo)的測試，但不能反應(yīng)水質(zhì)綜合毒性的大小。傳統(tǒng)的生物監(jiān)測以水蚤、藻類或魚類為受試對象，雖然能反映毒物對生物的直接影響，但是這些方法的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)過程比較繁瑣。針對傳統(tǒng)生物毒性檢測方法的不足，研究和開發(fā)新型生物毒性監(jiān)測技術(shù)——發(fā)光細(xì)菌法。該方法以簡便的操作方式、測量結(jié)果一目了然，受到了科研單位和企業(yè)的青睞。

自1672年R．Boyle觀察到發(fā)光的菌體所發(fā)出的光易被化學(xué)物質(zhì)抑制后，許多科學(xué)家相繼對細(xì)菌的發(fā)光效應(yīng)進(jìn)行了大量的研究。本世紀(jì)70年代至80年代初，國外科學(xué)家從海魚體表分離和篩選出對人體無害，對環(huán)境敏感的發(fā)光細(xì)菌，用于檢測水體生物毒性，現(xiàn)已成為一種簡單、快速的生物毒性檢測手段。80年代初我國引進(jìn)了這項(xiàng)技術(shù)，并先后分離出海水型和淡水型（青?；【┑陌l(fā)光細(xì)菌，用以檢測環(huán)境污染物的急性生物毒性。

一般發(fā)光細(xì)菌長約1.5-3um（微米），寬度0.5-0.8um，因此肉眼根本看不到，要用顯微鏡放大至1千倍時(shí)方可以分辨它們的體形。而它們的發(fā)光，也要在特定的條件中才能看得見。青?；【堑姆侵虏⌒偷l(fā)光菌，所以產(chǎn)品青?；【鷥龈煞墼谶\(yùn)輸、使用過程中安全可靠，對廢棄的菌液也不用進(jìn)行特殊處理，不會引起二次污染。

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