CRISPR-Cas9系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，已迅速成為基因編輯領(lǐng)域的核心工具，廣泛應(yīng)用于疾病模型構(gòu)建、生物通路解析及遺傳疾病治療。然而，CRISPR-Cas9在體內(nèi)的有效遞送仍是其臨床應(yīng)用的主要障礙。病毒載體因其高效性和組織特異性被廣泛使用，但其免疫原性和基因組整合風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用。非病毒載體如脂質(zhì)納米顆粒（LNP）因低毒性和可控的遞送效率而備受關(guān)注，但傳統(tǒng)LNP主要分布于肝臟，對(duì)肺等非肝臟組織的遞送效率較低。本研究旨在開發(fā)一種能夠高效遞送CRISPR-Cas9 RNP至肺部的LNP制劑。
材料與方法
采用微流體混合技術(shù)，將可電離脂質(zhì)、DOTAP、中性輔助脂質(zhì)DOPE、膽固醇及PEG化脂質(zhì)按特定比例混合于乙醇相，同時(shí)將Cas9蛋白與sgRNA按1:1摩爾比混合于PBS緩沖液中形成RNP復(fù)合物，兩相混合后形成LNP。通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和ζ電位分析表征LNP的粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）及表面電荷。合成一系列可電離脂質(zhì)庫，通過微流體混合技術(shù)形成LNP庫，并封裝針對(duì)EGFP的RNP。利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估各LNP在H1299細(xì)胞中的基因敲除效率，篩選出高效LNP。進(jìn)一步采用設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（DOE）方法，優(yōu)化LNP的脂質(zhì)組成，評(píng)估其對(duì)RNP及單鏈DNA（ssDNA）的封裝和遞送效率。采用高通量DNA條形碼技術(shù)，將特異性DNA條形碼引入各LNP制劑中，混合后靜脈注射至小鼠體內(nèi)。6小時(shí)后收集心、肺、脾、腎、肝及淋巴結(jié)等器官，通過下一代測序（NGS）分析各器官中DNA條形碼的分布，評(píng)估LNP的體內(nèi)生物分布特性。
選擇高效且具有肺部趨向性的LNP制劑（A14），封裝針對(duì)loxP位點(diǎn)的雙sgRNA，靜脈注射至Ai14/Ai6交叉小鼠體內(nèi)。通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分析肺內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞的基因編輯效率。同時(shí)，評(píng)估該LNP制劑在編輯臨床相關(guān)基因靶點(diǎn)（如TTR）中的效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 LNP制劑的篩選與優(yōu)化結(jié)果：
初始離子化脂質(zhì)篩選：通過高通量篩選技術(shù)，我們對(duì)24種不同的離子化脂質(zhì)進(jìn)行了評(píng)估，這些脂質(zhì)被用于構(gòu)建封裝CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）。篩選過程中，我們利用流式細(xì)胞術(shù)測量了H1299細(xì)胞中增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的敲除效率，作為評(píng)估LNP基因編輯效能的指標(biāo)。結(jié)果顯示，四種離子化脂質(zhì)（C12-5、C14-2、C14-5、C14-7）表現(xiàn)出高效的基因敲除能力，其效果與商業(yè)化的CRISPRmax對(duì)照相當(dāng)，甚至在某些劑量下表現(xiàn)更優(yōu)（圖1C, D）。
Figure 1. Identification of top ionizable lipids for in vitro gene knockout.
設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（DOE）優(yōu)化LNP脂質(zhì)組成：為了進(jìn)一步優(yōu)化LNP的脂質(zhì)組成，我們采用了設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（DOE）方法，構(gòu)建了一個(gè)包含7776種可能LNP配方的設(shè)計(jì)空間，但僅通過測試25種代表性LNP來評(píng)估。這25種LNP封裝了針對(duì)EGFP的RNP和單鏈DNA（ssDNA），用于評(píng)估基因敲除（通過非同源末端連接，NHEJ）和敲入（通過同源定向修復(fù)，HDR）效率。結(jié)果顯示，六種LNP配方（A3, A4, A5, A14, A21, A22）在H1299細(xì)胞中表現(xiàn)出高效的基因編輯能力，與基礎(chǔ)配方相當(dāng)。進(jìn)一步的多重線性回歸分析表明，離子化脂質(zhì)類型對(duì)基因編輯效率的影響最為顯著，其次是蛋白-脂質(zhì)重量比和DOPE含量（圖3）。
Figure 2. Optimizing LNP excipient components for RNP and ssDNA delivery and resulting knock-in editing using a design of experiment (DOE) approach. (A) DOE allows for a design space of 7776 LNPs to be analyzed by testing only 25 LNPs.
Figure 3. Identifying LNP components that significantly influence knockout and knock-in efficiencies.2.2 體內(nèi)生物分布評(píng)估結(jié)果：
高通量DNA條形碼技術(shù)：為了評(píng)估LNP在體內(nèi)的生物分布特性，我們采用了一種高通量DNA條形碼技術(shù)。每種LNP制劑中引入了特異性DNA條形碼，混合后靜脈注射至小鼠體內(nèi)。6小時(shí)后，收集心、肺、脾、腎、肝及淋巴結(jié)等器官，通過下一代測序（NGS）分析各器官中DNA條形碼的分布。結(jié)果顯示，不同LNP制劑在體內(nèi)的生物分布存在顯著差異，但基于DOTAP的肺部趨向性機(jī)制在高通量篩選中未得到準(zhǔn)確反映（圖4）。Figure 4. High-throughput evaluation of in vivo organ accumulation using DNA barcoding.對(duì)照篩選：為了驗(yàn)證高通量篩選的結(jié)果，我們選擇了四種LNP制劑（基礎(chǔ)LNP、A9、A14、A24）進(jìn)行個(gè)體對(duì)照篩選。這些LNP被標(biāo)記上DiR熒光染料，并單獨(dú)靜脈注射至小鼠體內(nèi)。通過體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）觀察LNP在肺部的積累情況。結(jié)果顯示，A9、A14和A24在肺部的積累量顯著高于基礎(chǔ)LNP，尤其是A9表現(xiàn)出最高的肺部積累（圖4F）。然而，高通量篩選中未準(zhǔn)確預(yù)測到A9的高肺部趨向性，這可能與凝血機(jī)制及LNP劑量有關(guān)。Figure 5. Four LNP formulations identified the base LNP, A9, A14, and A24 show dose-responsive editing in vitro and limited toxicity only at the highest dose tested.
2.3 體內(nèi)基因編輯評(píng)估結(jié)果：
Ai14/Ai6交叉小鼠模型中的基因編輯：為了評(píng)估LNP在體內(nèi)的基因編輯效率，我們選擇了高效且具有肺部趨向性的A14 LNP制劑，封裝了針對(duì)loxP位點(diǎn)的雙sgRNA，并靜脈注射至Ai14/Ai6交叉小鼠體內(nèi)。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)A14 LNP在肺內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞中均實(shí)現(xiàn)了高效的基因編輯，編輯效率隨劑量增加而提高（圖6C, D）。特別是在單次注射后，A14 LNP在肺單核細(xì)胞中的編輯效率達(dá)到近8%，在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中分別達(dá)到16%和6%。TTR基因編輯模型中的特異性：為了評(píng)估A14 LNP在編輯臨床相關(guān)基因靶點(diǎn)中的特異性，我們構(gòu)建了TTR基因編輯模型。A14 LNP封裝了針對(duì)TTR的sgRNA，并靜脈注射至小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，A14 LNP僅在肺部實(shí)現(xiàn)了高效的TTR基因編輯，未觀察到肝臟脫靶效應(yīng)（圖6F）。相比之下，基礎(chǔ)LNP在肺部和肝臟均實(shí)現(xiàn)了基因編輯，導(dǎo)致血清中前白蛋白水平顯著降低。這一結(jié)果表明，A14 LNP制劑具有高度的特異性，能夠有效避免肝臟脫靶效應(yīng)。Figure 6. Base, A14, and A24 LNP formulations show variable biodistributions and gene editing in vivo. 討論
本研究成功開發(fā)了一種具有肺部趨向性的LNP制劑（A14），該制劑能夠高效遞送CRISPR-Cas9 RNP至肺內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)針對(duì)模型報(bào)告基因及臨床相關(guān)基因靶點(diǎn)的基因編輯，且在肝臟中未觀察到脫靶效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)為CRISPR-Cas9技術(shù)在肺部疾病治療中的應(yīng)用提供了新的遞送策略，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
參考文獻(xiàn)：Haley, Rebecca M., et al. "Lipid Nanoparticles for In Vivo Lung Delivery of CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins Allow Gene Editing of Clinical Targets." ACS nano (2025).
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