在細(xì)胞生物學(xué)研究中，對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行熒光標(biāo)記和示蹤是觀察細(xì)胞行為、分析細(xì)胞相互作用以及研究細(xì)胞遷移和分布的重要手段。DiO (DiOC18(3))作為一種綠色熒光的親脂性膜染料，憑借其染色機(jī)制和優(yōu)異的性能，成為細(xì)胞膜標(biāo)記領(lǐng)域的理想選擇。

一、DiO 的染色機(jī)制與特性

DiO 是一種親脂性羰花青染料，其在水溶液中熒光較弱，但當(dāng)嵌入細(xì)胞膜后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，同時(shí)光穩(wěn)定性也得到顯著提升。這種熒光增強(qiáng)效應(yīng)歸因于 DiO 分子與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的相互作用。DiO 分子具有疏水性，能夠自發(fā)地插入到細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，并沿著膜平面進(jìn)行側(cè)向擴(kuò)散。隨著 DiO 分子在細(xì)胞膜中的逐漸擴(kuò)散，整個(gè)細(xì)胞膜會(huì)被均勻染色，發(fā)出明亮的綠色熒光。

DiO 的熒光信號(hào)穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長(zhǎng)時(shí)間的觀察和檢測(cè)中表現(xiàn)出色。此外，DiO 對(duì)細(xì)胞的毒性極低，通常不會(huì)影響細(xì)胞的正常生理功能和生存力，適用于活細(xì)胞的長(zhǎng)期示蹤和觀察。

二、DiO 的應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞膜標(biāo)記

DiO 最常見的應(yīng)用是對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，以觀察細(xì)胞的形態(tài)和行為。在細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與 DiO 染色液混合孵育，DiO 分子會(huì)迅速插入到細(xì)胞膜中并發(fā)出熒光。通過(guò)熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細(xì)胞膜的輪廓和形態(tài)變化。

DiO 標(biāo)記的細(xì)胞膜熒光信號(hào)均勻且穩(wěn)定，能夠長(zhǎng)時(shí)間保持熒光強(qiáng)度，適用于多種細(xì)胞類型，包括貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。標(biāo)記后的細(xì)胞可以用于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞相互作用研究等。

細(xì)胞示蹤

DiO 被廣泛用于細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)，特別是在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。它可以作為正向或逆向的示蹤劑，用于標(biāo)記和追蹤神經(jīng)元及其突起。在神經(jīng)組織切片或活體動(dòng)物模型中，DiO 標(biāo)記的神經(jīng)元可以通過(guò)熒光成像技術(shù)進(jìn)行長(zhǎng)期觀察，揭示神經(jīng)元的連接模式、信號(hào)傳導(dǎo)路徑以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化。

此外，DiO 還可以用于標(biāo)記和追蹤其他類型的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，DiO 標(biāo)記的細(xì)胞可以通過(guò)熒光成像技術(shù)實(shí)時(shí)觀察其在生物體內(nèi)的分布、遷移和存活情況，為細(xì)胞治療、組織工程和腫瘤轉(zhuǎn)移等研究提供重要數(shù)據(jù)支持。

三、DiO 的操作使用方法

染色前準(zhǔn)備

在進(jìn)行 DiO 染色之前，需要準(zhǔn)備好細(xì)胞樣本。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)基成分。對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接收集細(xì)胞并進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞調(diào)整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續(xù)的染色和檢測(cè)。

染色過(guò)程

將準(zhǔn)備好的細(xì)胞與 DiO 染色液混合，DiO 的常用工作濃度為 5 - 20 μM。將混合后的細(xì)胞懸液置于 37℃、5% CO? 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 5 - 30 分鐘。在孵育過(guò)程中，DiO 分子會(huì)插入到細(xì)胞膜中，產(chǎn)生綠色熒光。孵育時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的染色效果。

染色后處理

孵育完成后，用 PBS 輕輕洗滌細(xì)胞兩次，去除未結(jié)合的染料。對(duì)于需要進(jìn)行細(xì)胞膜標(biāo)記觀察的樣本，將標(biāo)記后的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入適量的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于需要進(jìn)行細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)的樣本，將標(biāo)記后的細(xì)胞用于后續(xù)的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)。使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，設(shè)置 488 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)和 500 - 550 nm 的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)通道，收集綠色熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記和示蹤。

四、DiO 的優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)

優(yōu)勢(shì)

• 低細(xì)胞毒性：DiO 對(duì)細(xì)胞的毒性極低，不會(huì)顯著影響細(xì)胞的正常生理功能，適用于長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)觀察。

• 良好的細(xì)胞膜通透性：DiO 能夠快速穿透細(xì)胞膜并插入到脂質(zhì)雙層中，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記。

• 穩(wěn)定的熒光信號(hào)：DiO 嵌入細(xì)胞膜后，熒光信號(hào)穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，適合長(zhǎng)時(shí)間的熒光觀察和檢測(cè)。

• 多色熒光標(biāo)記：DiO 發(fā)出綠色熒光，可與其他發(fā)出不同顏色熒光的染料（如 DiI、DiR）聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)多色熒光標(biāo)記，為復(fù)雜生物過(guò)程的研究提供了更全面的視角。

注意事項(xiàng)

• 染色濃度優(yōu)化：使用 DiO 時(shí)，需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化染色濃度。濃度過(guò)高可能導(dǎo)致細(xì)胞膜過(guò)度染色或細(xì)胞毒性增加，而濃度過(guò)低則可能使熒光信號(hào)不足。

• 避光操作：DiO 染料對(duì)光敏感，操作過(guò)程中應(yīng)盡量減少樣本的光照時(shí)間，以防止熒光淬滅。

• 背景熒光控制：在染色過(guò)程中，需確保染色步驟的規(guī)范性，以減少背景熒光。例如，孵育后應(yīng)充分洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的染料。

• 保存條件：DiO 染料應(yīng)密封保存于干燥、避光的環(huán)境中，避免接觸強(qiáng)光和高溫，以保持其活性和穩(wěn)定性。