圖2. Rd-TTPA的亞細胞分布和體外抗腫瘤作用

如圖2A–C所示，Rd-TTPA的紅色通道熒光與MTG（商業(yè)線粒體染料）的綠色熒光很好地融合，而Hoechst 33342的藍色熒光僅能染色細胞核。Rd-TTPA與MTG的Pearson系數(shù)為0.90，而Rd-TTPA和Hoechst 33342為0.13（圖2B），表明探針主要靶向線粒體。相比之下，Rd-TTPA對LTG（商業(yè)溶酶體染料）的皮爾遜系數(shù)僅為0.57（圖2B），證實了Rd-TTPA靶向線粒體的潛力。

采用MTT法評價Rd-TTPA的體外抗腫瘤作用。如圖2D所示，在沒有超聲波照射的情況下，Rd-TTPA的毒性可以忽略不計，即使Rd-TTPA濃度升至30μM，細胞存活率仍可達90%。然而，在超聲照射下，4T1細胞的活性隨著Rd-TTPA濃度的增加而降低。Rd-TTPA+US組的IC50值為7.88μM。此外，使用通過活細胞和死細胞染色（鈣黃綠素AM和PI）結(jié)果證明了Rd-TTPA在體外具有優(yōu)異的抗腫瘤活性。如圖2E所示，包括Rd-TTPA組和US組在內(nèi)的對照組中僅出現(xiàn)綠色熒光信號，表明Rd-TTPA的細胞毒性可以忽略不計，超聲波照射對細胞存活率的影響微不足道。然而，在Rd-TTPA+US組中，有一半的細胞顯示出強烈的紅色熒光信號，而綠色熒光信號則急劇下降，這表明Rd-TTPA可以作為一種有效的聲增敏劑來導致細胞死亡。這些結(jié)果證明，Rd-TTPA在細胞中具有優(yōu)異的聲動力學抗腫瘤活性。

圖3. 評價Rd-TTPA誘導細胞焦亡的能力

細胞焦亡是由GSDM蛋白家族介導的，該家族包含一個C端抑制結(jié)構(gòu)域和一個N端成孔結(jié)構(gòu)域，后者在炎癥性胱天蛋白酶激活后釋放，可以在細胞膜上形成孔，導致細胞膜破裂和焦亡的發(fā)生。研究者首先使用LSCM觀察了超聲照射下與Rd-TTPA孵育的4T1細胞的形態(tài)變化。在超聲波照射10分鐘后，發(fā)現(xiàn)只有用Rd-TTPA處理的4T1細胞形成了一些氣泡狀突起，稱為細胞質(zhì)膜染色染料DIO染色的焦亡體（圖3A）。此外，Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，在這個過程中，細胞核保持完整，而不是分裂（凋亡的一個標志），這與細胞焦亡的典型特征一致。相比之下，對照細胞沒有發(fā)現(xiàn)氣泡狀突起，細胞僅用Rd TTPA或超聲波照射處理。因此，研究者認為Rd-TTPA可以在SDT下充當焦亡生物調(diào)諧器。為了進一步揭示焦亡激活的途徑，對不同處理的4T1細胞進行了蛋白質(zhì)印跡分析。Caspase-1/Gasdermin-D（GSDMD）被認為是焦亡起始的主要途徑。在Rd-TTPA+US組中，caspase-1和GSDMD-N片段的表達水平顯著，而在對照組、Rd-TTPA組和US組中沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。Western blot結(jié)果表明，超聲誘導的O2-•產(chǎn)生通過胱天蛋白酶-1/GSDMD途徑啟動了細胞焦亡（圖3B-D）。由于焦亡過程中產(chǎn)生的GSDMD-N可以觸發(fā)膜孔的形成并導致IL-1β等炎性細胞因子的釋放，因此測量了各組細胞培養(yǎng)基中IL-1β的相對釋放量。Rd-TTPA+US組的IL-1β含量高于其他組，這與GSDMD觸發(fā)細胞膜孔的預期一致（圖3E）。此外，隨著膜孔的形成，細胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）可能會逐漸釋放到細胞外液中，還確定了各組LDH的滲漏情況。與其他組相比，Rd-TTPA+US組LDH的釋放增加更為顯著（圖3F）。這些結(jié)果表明，基于Rd TTPA的SDT可以啟動caspase-1/GSDMD通路，誘導細胞膜孔的形成，進一步促進細胞焦亡的發(fā)生。

研究表明，細胞焦亡可以啟動腫瘤特異性免疫，從而介導免疫原性細胞死亡（ICD），是增強腫瘤免疫治療的有力策略?？梢酝ㄟ^檢測兩個重要標志物CRT和HGMB-1的表達來評估Rd-TTPA誘導細胞焦亡增強ICD的能力。此后，與Rd-TTPA共孵育的4T1細胞在超聲照射下在細胞表面顯示出顯著增加的CRT信號，表明細胞焦亡過程中細胞表面CRT含量增加（圖3G）。除CRT外，其他組僅在細胞核中檢測到HMGB1，而在超聲照射下與Rd-TTPA共孵育的4T1細胞中，HMGB1的表達遷移到整個細胞中。Rd-TTPA+US組細胞質(zhì)中ATP含量也顯著增加。這些結(jié)果表明，在超聲照射下，Rd-TTPA誘導的細胞焦亡有效地導致ICD并引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

圖4. Rd-TTPA在缺氧條件下的抗腫瘤作用

腫瘤缺氧可增強腫瘤對基于ROS的癌癥療法（如PDT和SDT）的抵抗力，導致治療效果降低。因此，通過在三氣體培養(yǎng)箱中創(chuàng)造缺氧條件模擬腫瘤缺氧微環(huán)境，從而評估Rd-TTPA是否可以在缺氧條件下誘導焦亡并介導抗腫瘤作用（2%O2，圖4A）。DCFH-DA用于評估Rd TTPA在缺氧條件下（含氧量：2%）產(chǎn)生ROS的能力。與Rd-TTPA一起孵育的缺氧4T1細胞顯示出DCF的綠色熒光特征，而其他組沒有出現(xiàn)顯著變化（圖4D）。此外，還通過DHE染色評估了Rd-TTPA在缺氧條件下產(chǎn)生O2-•的能力。

在超聲照射下，缺氧的Rd-TTPA負載的4T1細胞中呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光，而其他組則顯示出稀少的紅色熒光（圖4D）。Rd-TTPA的缺氧SDT結(jié)果與其在常氧條件下的ROS產(chǎn)生曲線一致，證明了Rd-TTPA通過O2依賴性SDT在缺氧腫瘤中起作用的可行性。MTT法用于評估Rd-TTPA的抗腫瘤效率。如圖4B所示，在缺氧條件下，Rd-TTPA對4T1細胞的細胞毒性可以忽略不計。在超聲照射下，Rd-TTPA在低氧（2%O2）條件下顯示出對癌癥細胞的劑量依賴性，IC50值（最大抑制濃度的一半）為9.92μM，僅略低于正常氧氣條件下的IC50（21%O2條件下IC50=7.88μM，圖4C）。隨后，活細胞/死細胞染色更直觀地證實了Rd-TTPA在缺氧條件下對4T1細胞具有良好的殺傷作用（圖4F）。為了研究Rd-TTPA在缺氧條件下是否能有效激活焦亡，通過LSCM觀察了細胞的形態(tài)變化。在超聲照射下與Rd-TTPA一起孵育的缺氧4T1細胞表現(xiàn)出明顯的細胞形態(tài)變化，包括細胞膜溶解和焦亡體形成（圖4E），這與常氧條件下的焦亡特征相似（圖4A）。因此，研究者得出結(jié)論，即使在缺氧環(huán)境中，Rd-TTPA也能誘導焦亡，這可能是由于基于SDT的O2-•發(fā)生器和焦亡誘導劑Rd-TTPA在超聲波照射下通過一種不依賴O2的治療途徑產(chǎn)生O2-•。Rd-TTPA的這種特性使其成為治療深部和缺氧性腫瘤的有價值的治療方法。

圖5. Rd-TTPA的體內(nèi)抗腫瘤作用

鑒于Rd-TTPA在體外具有出色的NIR-II熒光發(fā)射，使用NIR-II體內(nèi)圖像系統(tǒng)研究了Rd-TTPA的腫瘤積累和體內(nèi)成像能力。首先，在腫瘤內(nèi)注射Rd-TTPA 0-48小時后，小鼠腫瘤中1000 nm長通（LP）通道的熒光幾乎沒有明顯變化（圖5C），表明其具有優(yōu)異的NIR-II成像能力和Rd-TTPA在腫瘤中的長保留時間。靜脈注射Rd-TTPA后，腫瘤部位的NIR-II熒光亮度隨時間增加，在8小時達到最大強度，96小時的熒光信號仍然明亮?；铙w結(jié)果表明，Rd TTPA可以靶向并集中在腫瘤中，并且具有較長的腫瘤保留時間（約96小時），這有利于腫瘤的特異性NIR-II熒光成像和活體小鼠的成像引導SDT。

鑒于其在細胞和體內(nèi)的優(yōu)異性能，研究者通過焦亡增強SDT進一步證明了Rd-TTPA對4T1荷瘤小鼠的抗腫瘤作用。首先，通過將4T1細胞皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后肢建立4T1腫瘤攜帶模型（圖5A）。然后，用不同的治療方法治療荷瘤小鼠：（i）PBS，（ii）Rd-TTPA，（iii）US和（iv）Rd-TTPA+US，每2天一次，并監(jiān)測和記錄腫瘤體積14天。Rd-TTPA+US組的皮下腫瘤在14天的SDT治療后沒有明顯生長，而其他組的腫瘤體積在視覺上有所增大，這表明Rd-TTPA可以通過SDT有效抑制腫瘤生長（圖5B和D）。同時，各組荷瘤小鼠在不同治療14天后體重沒有顯著變化，表明Rd-TTPA不影響小鼠的存活和生長（圖5F）。隨后，通過組織學研究證實了Rd-TTPA的抗腫瘤作用。腫瘤組織切片的蘇木精和伊紅（H&E）染色表明，對照組和另外兩組（僅Rd TTPA和僅US）的細胞形態(tài)正常，而Rd-TTPA+US組的腫瘤細胞明顯被破壞，表明基于Rd-TTPA的SDT具有出色的抗腫瘤效力，Ki-67染色進一步證實了這一點（圖5G）。與對照組相比，Rd-TTPA+US組腫瘤組織中胱天蛋白酶-1和GSDMD-N的表達含量顯著上調(diào)，表明SDT治療腫瘤時發(fā)生了焦亡（圖5E）。

總之，研究者創(chuàng)建了一種具有NIR-II發(fā)射的小分子焦亡生物調(diào)諧器Rd-TTPA，以在NIR-II熒光成像的指導下實現(xiàn)焦亡增強聲動力腫瘤治療。A-π-D1-D2型結(jié)構(gòu)增強了供體-受體相互作用，有利于Rd-TTPA的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和三重態(tài)形成，促進了其聲動力學和NIR-II熒光性能。在超聲波照射下，Rd-TTPA通過大量O2-•的產(chǎn)生誘導腫瘤細胞焦亡。Western Blot研究進一步揭示，Rd-TTPA介導的焦亡機制涉及Caspase-1/GSDMD通路。即使在缺氧條件下（2%O2），Rd-TTPA也能誘導焦亡并有效消融腫瘤細胞，表明SDT介導的焦亡是低O2依賴性的。體內(nèi)腫瘤治療揭示了Rd TTPA通過焦亡增強SDT和ICD的優(yōu)異抗腫瘤作用。因此，本研究為設(shè)計一種聲動力學生物調(diào)諧器提供了一種有前景的策略，用于通過NIR-II成像引導的SDT激活實體瘤的焦亡，并將推動新型聲敏化劑在腫瘤治療中的開發(fā)和應(yīng)用。

參考文獻

Wang X, Chi W, Wu J, et al. A NIR-II emissive sonosensitized biotuner for pyroptosis-enhanced sonodynamic therapy of hypoxic tumors[J]. Biomaterials, 2025, 315: 122969.