?

 近年來，液體活檢技術發(fā)展備受關注，其相對于常規(guī)組織活檢技術具有侵入性小、快速便捷、可重復性高等優(yōu)點，因此在癌癥的早篩、早診等方面產生了諸多突破性進展。它通過分析血液或尿液等中的生物標記物，如比較熱門的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）來檢測癌癥的存在。然而，由于ctDNA僅能檢測DNA，且會受到其它因素污染，因此對循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）如RNA和蛋白質的分析變得越來越重要（如圖1），而隨著代謝組學的發(fā)展，越來越多的代謝物標志物被認為是潛在的反映癌癥發(fā)生的敏感標記物。從血液中分離出活的CTCs，將其進行濃縮，并了解培養(yǎng)癌細胞的培養(yǎng)基中所含微量代謝物的變化，可為液體活檢研究做出重大貢獻。

圖1 液體活檢研究目標概述

利用氣相色譜質譜聯(lián)用（GC-MS）的方法即可以對培養(yǎng)基中的初級代謝物進行分析，然而GC-MS對于代謝物的快速篩查及代謝通路研究方面仍存在一定挑戰(zhàn)，為了克服這些挑戰(zhàn)，島津針對代謝物分析開發(fā)了專用的GC-MS數(shù)據庫（Smart Metabolites Database），其涵蓋600多種化合物的質譜圖、保留指數(shù)、MRM離子對等信息，可在無標準品的情況下快速排除干擾組分輕松實現(xiàn)樣品中代謝物的快速篩查。

本應用即利用島津GCMS-TQ8040 NX和Smart Metabolites Database Ver.2在23分鐘內就完成了兩種CTCs樣品(H358和H1975肺癌細胞)中500多種代謝組分的同時測定。這兩種CTCs通過智能活檢細胞分離器（Smart Biopay Cell Isolator）分離獲得，并分別在0、1、10、50和100個細胞的獨立培養(yǎng)基中培養(yǎng)。智能活檢細胞分離器采用基于重力過濾的HDM技術，通過特殊涂層更大限度地提高回收率，每個樣品均以高通量的方式在25分鐘內分離活CTCs。然后使用eMSTAT Solution Ver.2和多組學分析方法包進行統(tǒng)計分析，通過可視化的方法呈現(xiàn)ANOVA（方差分析）和代謝通路圖的結果，進而了解CTC數(shù)量與代謝通路上的代謝物之間的相關性。

利用ANOVA進行代謝通路分析

下圖2中通過ANOVA計算未使用的培養(yǎng)基（含0個癌癥細胞的培養(yǎng)基，藍色）、含有50/100個H358肺癌細胞的培養(yǎng)基（紅色）和含有50/100個H1975肺癌細胞（黃色）的培養(yǎng)基的p值，并將p值在5%及以下的代謝物投影到多組學分析方法包的代謝物通路圖上。

可以看出，在H358培養(yǎng)基中，甘油酯代謝通路上游區(qū)域的底物（二羥丙酮磷酸和甘油磷酸酯)水平特別低，甲基乙二醛是二羥丙酮磷酸的副產物，由于糖酵解的增加，癌細胞傾向于產生甲基乙二醛作為副產物。

圖2 使用eMSTAT Soutions Ver.2進行ANOVA，并將結果投影到多組學分析方法包的代謝通路圖上

CTC數(shù)量與代謝通路上的代謝物的相關性分析

利用多組學方法包的代謝通路分析功能，進行CTC數(shù)量（0、1、10、50、100）與代謝物之間的相關性分析（如圖3）。結果顯示，色氨酸通路中的中間代謝物多巴胺與H358呈正相關（據了解肺癌患者血漿中的多巴胺水平明顯高于健康受試者，其因果關系有望在以后的研究中得到闡明）。此外，在甘油三酯合成通路中，甘油磷酸酯與H358細胞數(shù)量呈正相關，眾所周知，將甘油磷酸酯轉化為1,3-二磷酸甘油酸的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（NADP+）在肺癌細胞中高表達。因此，本實驗中甘油磷酸酯的減少也被認為是由于甘油醛-3-磷酸脫氫酶（NADP+）的增加。

圖3 搜索與CTC計數(shù)相關的代謝物

結論                     

通過GC-MS和智能代謝物數(shù)據庫分析培養(yǎng)了癌癥細胞的培養(yǎng)基中代謝物的情況，并結合多組學方法包的代謝通路分析功能，分析CTC數(shù)量與代謝物之間的相關性，將有助于液體活檢相關的方法研究。

代謝物數(shù)據庫特點

• 超過600種代謝化合物信息，提供氨基酸、脂肪酸和糖的專用分析方法，輕松實現(xiàn)代謝物泛范圍篩查。

• 代謝物MRM信息數(shù)據庫，無需標準品即可快速創(chuàng)建高靈敏度分析方法

• 新增糖專用分析方法和功能性成分化合物信息擴展樣品分析范圍

• 新增過濾功能，允許用戶只選擇和分析給定樣品中可能被檢測到的代謝物，節(jié)省分析時間和勞動力

• “代謝組學手冊”全方位說明從樣品準備到多變量分析的每個步驟，即使是初學者亦可以輕松應對。

實驗儀器

聲明：本文涉及內容非醫(yī)療用途，僅供專業(yè)人士學習及相關研究參考使用

本文內容非商業(yè)廣告，僅供專業(yè)人士參考。