簡介

DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一種熒光染料，常用于核 DNA 染色。它用于熒光顯微鏡、染色體擴(kuò)散、FACS 和細(xì)胞檢測等成像實驗 【1-4】。然而，紫外光激發(fā)會導(dǎo)致 DAPI 的光轉(zhuǎn)換，從而在成像系統(tǒng)的 FITC/GFP 通道中檢測 DAPI 熒光，從而導(dǎo)致結(jié)果解釋錯誤 【5， 6】。DAPI 還需要固定細(xì)胞以實現(xiàn)染色。在這個亮點中，我們展示了 DAPI 染色的一些替代方法，包括 StainFree 技術(shù)，該技術(shù)不需要染色，并且可與活細(xì)胞一起使用。

Molecular Devices SpectraMax® i3 多功能微孔板酶標(biāo)儀采用 SpectraMax® MiniMax 300 成像細(xì)胞計數(shù)儀，使用StainFree 細(xì)胞檢測技術(shù)來定量細(xì)胞。這種非標(biāo)記方法使用透射光成像和復(fù)雜的軟件來識別單個細(xì)胞或細(xì)胞群。用戶可以“教導(dǎo)”軟件通過監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法來識別細(xì)胞。這使得科學(xué)家能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行計數(shù)并監(jiān)測細(xì)胞生長，而不會在昂貴的染色程序中損害細(xì)胞或損失時間和金錢。

DAPI 的另一種替代方法是 Molecular Devices EarlyTox 活細(xì)胞紅色染料。這種細(xì)胞滲透性紅色熒光染料可對培養(yǎng)物中所有細(xì)胞的核 DNA 進(jìn)行染色，無論其活性如何，并可在需要核染色的成像檢測中用作 DAPI 的替代物。在 622 nm 激發(fā)和 645 nm 峰值發(fā)射的情況下，活的紅色染料在成像檢測中不會干擾 FITC 通道。

我們進(jìn)行了一項細(xì)胞計數(shù)實驗，以證明 StainFree 技術(shù)和活細(xì)胞紅色染料方法與 DAPI 染色相比的性能。DAPI 的兩種替代方案均為用戶提供了對活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)的優(yōu)勢，而無需耗時的固定步驟。StainFree 技術(shù)使用戶不受染色程序的限制，并使他們能夠使用細(xì)胞進(jìn)行額外的下游分析。

優(yōu)勢

• 使用 StainFree 技術(shù)實現(xiàn)活細(xì)胞計數(shù)，同時無需染色前的固定步驟，避免昂貴
的染色程序
，節(jié)省時間和金錢

方法

CHO-K1 細(xì)胞以 20，000 至 300 個細(xì)胞/孔的密度接種到 96 孔板中，連續(xù)進(jìn)行兩倍稀釋，并在 37°C 下附著并生長過夜。 孵育后，在 37°C 下用含 4% 多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 固定孔的子集 30 分鐘。 固定后，用 1X PBS 洗滌細(xì)胞兩次，然后在 0.1% Triton X-100 中孵育 5 分鐘。用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，并用 PBS 中的 2.9 µM DAPI 染色 30 分鐘。染色后，用 PBS 洗滌細(xì)胞三次。

剩余的活細(xì)胞，并用活紅色染料染色。將染料儲備溶液在 PBS 中以 1：2000 的比例稀釋并添加到細(xì)胞中。孵育 30 分鐘后，使用 MiniMax 細(xì)胞儀上的透射光和紅色熒光 （Cy5） 通道對活細(xì)胞進(jìn)行成像。使用 SoftMax Pro 軟件進(jìn)行 StainFree 分析和核計數(shù)。圖 1 顯示了使用 StainFree 或 Live Red Dye 節(jié)省的時間。

為了進(jìn)行比較，在 ImageXpress® Micro XLS 寬場高內(nèi)涵分析系統(tǒng)中使用 Cy5 和 DAPI 通道對活（紅色染色）和固定（DAPI 染色）細(xì)胞進(jìn)行成像。按順序為比較兩個成像系統(tǒng)的細(xì)胞計數(shù)，將目標(biāo)區(qū)域 （ROI） 應(yīng)用于使用 
MiniMax 細(xì)胞計數(shù)器采集的圖像，以匹配 ImageXpress Micro XLS 系統(tǒng)上成像的區(qū)域。使用 SoftMax Pro 軟件創(chuàng)建圖形。

圖 1：使用 StainFree 技術(shù)與活紅色染料與DAPI。 與使用 DAPI 進(jìn)行固定和染色相比，StainFree 工作流程可節(jié)省約 70 分鐘的時間。此外，使用 StainFree 技術(shù)分析的細(xì)胞仍然存活，并可用于其他檢測。

結(jié)果

用活紅色染料染色并在 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)器的紅色熒光和透射光通道上成像的細(xì)胞如圖 2 所示。對于紅色熒光圖像，使用 SoftMax Pro 軟件中的預(yù)定義“Nuclei”設(shè)置來準(zhǔn)確識別染色的細(xì)胞核。對于在透射光通道中成像的細(xì)胞，使用 StainFree 技術(shù)來識別細(xì)胞。軟件中的預(yù)定義設(shè)置“CellsA”為這些 CHO 細(xì)胞實現(xiàn)了精確的結(jié)果。StainFree 細(xì)胞計數(shù)與熒光細(xì)胞核計數(shù)非常接近（圖 2，圖），表明 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)儀和 SoftMax Pro 軟件可準(zhǔn)確消除對細(xì)胞核染色計數(shù)的需求。使用 ImageXpress Micro XLSsystem 和 MetaXpress® 軟件對 DAPI 染色的細(xì)胞進(jìn)行成像和計數(shù)。對于比較，使用 Cy5 通道在同一系統(tǒng)上對活的紅色染料染色細(xì)胞進(jìn)行
成像。染色細(xì)胞的圖像如圖 3 所示。使用兩種染料的細(xì)胞計數(shù)非常接近（圖 3，圖）。通過此比較，我們確認(rèn)使用 DAPI 的細(xì)胞計數(shù)與使用 StainFree 技術(shù)的細(xì)胞計數(shù)相當(dāng)。

圖 2. 使用 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。 用活紅色染料染色的細(xì)胞在紅色熒光（左上）或透射光（中上）通道中成像。StainFree 細(xì)胞計數(shù)（右上角，紫色掩膜）與基于紅色細(xì)胞核染色的細(xì)胞計數(shù)密切相關(guān)，如圖所示（綠色圓圈，StainFree 計數(shù)；紅色圓圈，紅色細(xì)胞核計數(shù)）。兩條曲線的 r2 值為 0.99。

圖 3. 在 ImageXpress XLS 系統(tǒng)中計數(shù)的細(xì)胞。 對用活紅色染料（左上）或 DAPI（右上）染色的細(xì)胞進(jìn)行成像，并通過在 SoftMax Pro 軟件（下圖）中繪制圖表來證明使用兩種染料獲得的計數(shù)的密切相關(guān)性。對于兩條曲線，r2 均為 0.99。

結(jié)論

Stain Free 技術(shù) 和 Live Red Dye 在細(xì)胞計數(shù)方面與 DAPI 一樣有效，DAPI 需要在染色前進(jìn)行固定。StainFree 細(xì)胞計數(shù)是最大限度地提高細(xì)胞活性和減少細(xì)胞處理時間的好選擇，因為它既不需要熒光染料，也不需要固定。對于需要細(xì)胞核染料的情況，例如，為了監(jiān)測細(xì)胞核大小或染色水平，可以使用活的紅色染料代替 DAPI，但不需要固定。它也不會干擾綠色熒光成像，因為 DAPI 已被證明是如此。使用 StainFree 技術(shù)或 Live RedDye 可實現(xiàn)活細(xì)胞檢測的更多多功能性。