基本信息

• 用途：主要用于體外定量檢測生物樣本中糖化血紅蛋白 A1c 的含量，通常用于科研領(lǐng)域，如糖尿病相關(guān)的基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)等，而不能直接用于臨床診斷。

• 適用樣本類型：常見的有血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、尿液、分泌物等。

檢測原理

• 雙抗體夾心法：以兔糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒為例，用純化的糖化血紅蛋白 A1c 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入糖化血紅蛋白 A1c，再與 HRP 標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 抗體結(jié)合，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過che底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 濃度。

• 競爭法：如 Abbexa 公司的人糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒，是基于競爭酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)。先將抗體預(yù)包被到 96 孔板上，加入標(biāo)準(zhǔn)品、測試樣品和生*素標(biāo)記的試劑，生*素標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 和未標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 會在包被抗體上發(fā)生競爭抑制反應(yīng)，再加入 HRP 標(biāo)記的試劑，孵育后洗去未結(jié)合的結(jié)合物，加入 TMB 底物進行顯色，顏色變化與糖化血紅蛋白 A1c 的量成反比，通過測定 OD 值計算糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。

試劑盒組成

• 酶標(biāo)包被板：通常為 96 孔或 48 孔板，表面預(yù)包被有特異性抗體。

• 標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的糖化血紅蛋白 A1c，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便根據(jù)樣品的吸光度值計算其濃度。

• 酶標(biāo)試劑：一般為 HRP 標(biāo)記的抗體或其他酶標(biāo)記的試劑，用于與抗原或抗體結(jié)合，產(chǎn)生可檢測的信號。

• 顯色劑：如 TMB 底物，在酶的作用下發(fā)生顏色變化，用于指示反應(yīng)的結(jié)果。

• 終止液：用于終止顯色反應(yīng)，使顏色穩(wěn)定，便于測量吸光度。

• 洗滌液：用于洗滌反應(yīng)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少非特異性結(jié)合的干擾。

• 樣品稀釋液：用于稀釋樣品，使樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 濃度在試劑盒的檢測范圍內(nèi)。

操作步驟

1. 試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，在室溫平衡 15-30 分鐘。按照說明書要求稀釋洗滌液、配制酶標(biāo)工作液等。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育一定時間，使抗原與抗體充分結(jié)合。

4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù)多次，拍干，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。

5. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑，空白孔除外，然后進行溫育。

6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A，再加入顯色劑 B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色一定時間。

7. 終止：每孔加終止液，終止反應(yīng)，此時顏色會發(fā)生變化，如藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。

8. 測定：以空白孔調(diào)零，在 450nm 波長下依序測量各孔的吸光度（OD 值），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。

注意事項

• 試劑盒保存：應(yīng)按照說明書要求在 2-8℃條件下保存，避免冷凍和反復(fù)凍融，有效期一般為 6 個月左右。

• 操作規(guī)范：嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育，所有試劑在使用前需達到室溫 20-25℃。加樣要準(zhǔn)確，使用加樣器并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)。

• 避免污染：操作過程中要注意防止交叉污染，封板膜只限一次性使用，不同批號的試劑組分不得混用。

• 底物保存：底物顯色液應(yīng)避光保存，如發(fā)現(xiàn)底物液已經(jīng)變藍(lán)則不能使用。