| 供貨周期 |
一個月 |
應(yīng)用領(lǐng)域 |
化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
人可溶性腫瘤壞死因子α受體試劑盒，用雙抗夾心 ELISA 法測人樣本中 sTNFαR。操作含樣本準備等多步，各環(huán)節(jié)有要點，保障檢測精準度。
人可溶性腫瘤壞死因子α受體試劑盒
人可溶性腫瘤壞死因子α受體試劑盒，英文名稱為 Human soluble Tumor Necrosis Factorαreceptor，sTNFαR ELISA KIT，在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域占據(jù)重要地位，主要用于精準測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿及其他相關(guān)液體樣本中可溶性腫瘤壞死因子 α 受體（sTNFαR）的含量 。對 sTNFαR 含量的檢測，有助于深入探究人體免疫調(diào)節(jié)機制、炎癥反應(yīng)過程以及相關(guān)疾病的發(fā)病機理 。
一、檢測原理
該試劑盒普遍采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理 。在試劑盒所配備的酶標板孔內(nèi)，提前包被有針對人 sTNFαR 的特異性抗體。當開展檢測工作時，將標準品與經(jīng)過預(yù)處理的待測樣本依次加入酶標板孔中。樣本里的 sTNFαR 會迅速與包被在孔壁上的特異性抗體特異性結(jié)合 。經(jīng)過一段適宜時間的溫育，確保結(jié)合反應(yīng)充分完成后，通過洗滌操作去除未結(jié)合的雜質(zhì)以及其他干擾物質(zhì) 。緊接著，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的另一種 sTNFαR 特異性抗體 。這種酶標抗體能夠與已經(jīng)結(jié)合在包被抗體上的 sTNFαR 再次特異性結(jié)合，從而形成 “包被抗體 - sTNFαR - 酶標抗體" 的穩(wěn)定免疫復(fù)合物 。再次進行洗滌步驟，以徹di清除未參與反應(yīng)的多余酶標抗體 。隨后，向各孔中添加底物 TMB。在 HRP 的高效催化作用下，原本無色的 TMB 底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色產(chǎn)物 。反應(yīng)持續(xù)一段時間后，加入終止液，使反應(yīng)迅速停止，此時溶液顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。由于溶液顏色的深淺程度與樣本中 sTNFαR 的含量呈正相關(guān)關(guān)系，借助酶標儀在 450nm 波長下測量各孔溶液的吸光度（OD 值），并依據(jù)標準品的 OD 值繪制出精準的標準曲線，即可精確推算出待測樣本中 sTNFαR 的濃度 。
二、操作步驟
樣本準備：血清樣本采集后，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清；血漿樣本同樣按此離心條件處理，注意要依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集；細胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘，去除其中的細胞碎片和其他不溶性雜質(zhì)；組織勻漿要先將組織與適量生理鹽水混合，采用合適的勻漿方法制備，再經(jīng) 1000×g 離心 10 分鐘，取上清液備用 。若樣本不立即使用，應(yīng)分成小份，在 - 20℃或 -80℃環(huán)境下保存，防止反復(fù)凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻 。
試劑準備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致，并充分混勻 。同時，依據(jù)實驗所需檢測的樣本數(shù)量，確定酶標板的使用條數(shù)，標準品孔和空白孔建議設(shè)置復(fù)孔，以提高檢測結(jié)果的準確性與可靠性 。此外，要按照說明書要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準確稀釋成工作洗滌液 。
加樣：在酶標板上精確設(shè)置標準品孔、空白孔與待測樣本孔。向標準品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標準品，濃度梯度需嚴格按照試劑盒說明書進行配置；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑 。加樣時，務(wù)必使用微量加樣器，并確保加樣量準確，將樣本或標準品加于酶標板孔底部，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標板，使液體充分混勻 。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標板密封，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應(yīng)時間，具體溫育時長參照試劑盒說明書 。溫育結(jié)束后，小心揭去封板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干，此洗滌操作需重復(fù) 4 - 5 次，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì) 。若使用洗板機進行洗滌，需提前按照儀器操作規(guī)程進行設(shè)置，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當增加 1 - 2 次 。
后續(xù)反應(yīng)與檢測：每孔加入 100μL HRP 標記的檢測抗體，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘 。溫育結(jié)束后，重復(fù)上述洗滌步驟 。接著，每孔依次加入底物 A、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘 。顯色反應(yīng)結(jié)束后，迅速向每孔加入 50μL 終止液，加入終止液后應(yīng)立即使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值 。依據(jù)標準曲線，計算出樣本中 sTNFαR 的濃度，若樣本進行過稀釋，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到實際濃度 。
三、注意事項
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測結(jié)果的準確性 。同時，試劑使用后應(yīng)及時放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質(zhì) 。
樣本采集、處理過程務(wù)必嚴格遵循規(guī)范操作，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血、脂血等情況，以免干擾檢測結(jié)果 。如血清樣本應(yīng)避免溶血，紅細胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可能會增加以 HRP 為標記的 ELISA 測定中的非特異性顯色 。
洗滌過程至關(guān)重要，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì)，又要避免過度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)脫落 。洗滌液的配制應(yīng)準確無誤，洗滌次數(shù)和時間需嚴格按照說明書執(zhí)行 。
加樣操作要精準、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔，保證實驗條件的一致性 。使用加樣器時，需定期校準，確保加樣量的準確性 。
顯色反應(yīng)過程需嚴格控制時間和溫度，避免光線直射，以保證顯色效果的穩(wěn)定性 。加入終止液后，應(yīng)盡快進行 OD 值測定，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差 。
實驗過程中使用的所有耗材，如酶標板、吸頭、試管等，應(yīng)確保無污染且質(zhì)量可靠，避免對實驗結(jié)果造成影響 。
若對檢測結(jié)果存在疑問或出現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時檢查實驗操作過程、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時可重復(fù)實驗進行驗證 。
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