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活細(xì)胞表面受體二聚化/寡聚化分析

時(shí)間:2010/12/2閱讀:3405
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摘要: 目前有兩個(gè)不同的方向進(jìn)行受體二聚化/寡聚化檢測,一個(gè)是體外檢測,一個(gè)是活細(xì)胞檢測。CO-IP是應(yīng)用zui廣泛的檢測二聚化/寡聚化的體外方法?;罴?xì)胞檢測的方法主要基于能量共振轉(zhuǎn)移原理,包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF(TR-FRET)等。Tag-lite將SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技術(shù)結(jié)合起來,可以非常方便可靠地檢測活細(xì)胞受體二聚化/寡聚化。

G蛋白偶聯(lián)受體很久以來一直被認(rèn)為是以單體的形式存在,并且與配體結(jié)合進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的。然而,近年來,越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,有的GPCR可形成同源二聚體或異源二聚體而發(fā)揮作用。雖然這種聚集在與G蛋白結(jié)合方面的作用還存在爭議,但是許多GPCR確實(shí)可形成二聚體/寡聚體是毋庸置疑的,尤其是C類受體(class C receptor)。二聚體/寡聚體除了可能參與G蛋白結(jié)合,還可能在GPCR脫敏、GPCR合成后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細(xì)胞表面等過程中發(fā)揮作用。

 

 

二聚化/寡聚化的發(fā)現(xiàn)給新藥研發(fā)提供了新的思路,尤其是對于異源聚集。在這種模式下,藥物可能與一個(gè)GPCR結(jié)合,并共同活化了第二個(gè)GPCR,引起細(xì)胞反應(yīng)。如果我們只用其中一個(gè)GPCR去做篩選,很可能看不到有意義的結(jié)果。同時(shí),受體聚集的提出,給孤兒受體(orphan GPCR)也提出了新的解釋?;蛟S,這些孤兒受體可與其它GPCR形成二聚體/寡聚體,作為parter,而不是以單體的形式發(fā)揮作用。

有兩個(gè)不同的方向進(jìn)行受體二聚化/寡聚化檢測,一個(gè)是體外檢測,一個(gè)是活細(xì)胞檢測。CO-IP是應(yīng)用zui廣泛的檢測二聚化/寡聚化的體外方法。活細(xì)胞檢測的方法主要基于能量共振轉(zhuǎn)移(RET)原理,包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF(TR-FRET)等。Tag-lite將SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技術(shù)結(jié)合起來,可以非常方便可靠地檢測活細(xì)胞受體二聚化/寡聚化。

檢測原理

同源二聚體的檢測
構(gòu)建SNAP和GPCR的共表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,可表達(dá)SNAP-GPCR的融合蛋白。然后,加入分別標(biāo)記了Tb和Acceptor熒光染料的底物,則部分GPCR標(biāo)記了Tb(Tb-GPCR),部分標(biāo)記了Acceptor熒光染料(Acceotor-GPCR)。如果GPCR可以形成同源二聚體,配體刺激后,兩個(gè)GPCR會相互靠近并偶聯(lián)。Tb-GPCR與Acceptor-GPCR之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,檢測到HTRF信號,見圖1。

圖1:GPCR同源二聚體檢測模式

異源二聚體的檢測
分別構(gòu)建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染,可得到表達(dá)SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的細(xì)胞。加入標(biāo)記了Tb的SNAP底物和標(biāo)記了Acceptor熒光染料的CLIP底物,細(xì)胞表面的受體為Tb-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2。如果GPCR形成異源二聚體,配體刺激后,GPCR1/2相互靠近發(fā)揮作用。Tb與Acceptor之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,檢測到HTRF信號,見圖2。

圖2:GPCR異源二聚體檢測模式

HaloTag與SNAP相似,也是一個(gè)自身標(biāo)記的酶,通過與標(biāo)記了熒光的底物反應(yīng),將自身標(biāo)記上熒光。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,我們也可以構(gòu)建HaloTag與GPCR的表達(dá)載體。

檢測特點(diǎn)和優(yōu)勢
• 活細(xì)胞水平的檢測
• 檢測背景低:時(shí)間分辨熒光的檢測方式,沒有熒光染料自身的交叉干擾和來自樣品自發(fā)熒光的干擾
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠:FRET技術(shù)使檢測結(jié)果反映的是真正的受體聚集,而不是僅僅相互靠近
• 不需要抗體:Tag-lite利用的SNAP技術(shù),不需要抗體來確定實(shí)驗(yàn)的特異性

應(yīng)用領(lǐng)域
• 受體二聚化/寡聚化分析
• 孤兒受體的研究

應(yīng)用實(shí)例

C類GPCR:GPCRGABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測
分別構(gòu)建GABAB1與SNAP-Tag和GABAB2與HaloTag的表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。蛋白表達(dá)后,固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變,配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度,將兩種底物混合后加入細(xì)胞。孵育1h后,檢測HTRF信號,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

GABAB1與GABAB2形成異源二聚體發(fā)揮作用。隨著Halo-Red濃度的加大,有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上,HTRF信號增強(qiáng),直到達(dá)到平衡。

 

圖3:GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測

A類GPCR:多巴胺D2與Delta 阿片的異源二聚化檢測
分別構(gòu)建Delta阿片與SNAP-Tag和多巴胺與HaloTag的表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。蛋白表達(dá)后,固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變,配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度,將兩種底物混合后加入細(xì)胞。孵育1h后,檢測HTRF信號,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

  

圖4:GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測

多巴胺D2與Delta阿片形成異源二聚體發(fā)揮作用。隨著Halo-Red濃度的加大,有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上,HTRF信號增強(qiáng),直到達(dá)到平衡。

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