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產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是用于制備乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.操作簡單，即開即用，用戶不需要花時(shí)間優(yōu)化條件。

2.制備得到的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞可以-80℃保存一年，方便多次使用，免去每次轉(zhuǎn)化都要新鮮制備感受態(tài)細(xì)胞。

3.主要用于乳酸乳球菌，但能否用于其他乳球菌不詳。

4.最高轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到 2×10E7 個(gè)轉(zhuǎn)化子/?g 質(zhì)粒 DNA，但實(shí)際效率跟質(zhì)粒長度、質(zhì)粒濃度、恢復(fù)培養(yǎng)基等多種因素相關(guān)。

5.得到的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞可以用各種穿梭質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。

6.本試劑盒足夠制備 20 次，共 200 管乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞（每管 70  μL）。

7.乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備溶液 A50 mL×360 mL 本色瓶

乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備溶液 B50 mL60 mL 本色瓶

乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備溶液 C30 mL30 mL 本色瓶

使用手冊1 份無

運(yùn)輸及保存

常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

自備試劑

GM17 液體培養(yǎng)基、含 0.5 M 蔗糖和 1%甘-氨酸的 GM17 液體培養(yǎng)基、恢復(fù)培養(yǎng)基（含2 mM CaCl2 和 20 mM MgCl2 的 GM17 液體培養(yǎng)基）、600 nm 分光光度計(jì)、電轉(zhuǎn)儀。

使用方法：

一：電感受態(tài)細(xì)胞的制備

1.挑取平板劃線后培養(yǎng)得到的新鮮單菌落，接種到5 mL 自備的GM17 液體培養(yǎng)基中。

30℃靜置厭氧培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。

2.轉(zhuǎn)移 2.5 mL 上步所得培養(yǎng)菌液到 50 mL 自備的 GM17 液體培養(yǎng)基中。30℃靜置厭氧培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。

3.轉(zhuǎn)移 4 mL 上步所得培養(yǎng)菌液到自備的 250 mL 含 0.5 M 蔗糖和 2.5%甘氨-酸的GM17 液體培養(yǎng)基中，30℃靜置厭氧培養(yǎng)直到 OD600 達(dá)到 0.5-0.8 之間。

4.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無菌離心管中 6000 rpm 10 分鐘，棄上清。離心時(shí)將洗滌液 B 和洗滌液 C 放冰上預(yù)冷待用。

5.加入 7 mL 的溶液 A 重懸細(xì)菌。此時(shí)細(xì)菌的濃度約為 1×10E9 個(gè)/mL。

6.重懸后室溫放置 30 分鐘，4℃ 6000 rpm 10 分鐘，棄上清。室溫放置 30 分鐘很重要，不能跳過。

7.加入 1.5 mL 預(yù)冷的溶液B 重懸細(xì)菌，然后 4℃ 6000 rpm 10 分鐘，棄上清。

8.再加入 1.5 mL 預(yù)冷的溶液 C 重懸細(xì)菌，然后 4℃ 6000 rpm 10 分鐘，棄上清。

9.再加入 0.7 mL 預(yù)冷的溶液B 重懸細(xì)菌，按每管 70 L 分裝到 1.5-2.0 mL 的離心管中，此時(shí)細(xì)菌的濃度約為 1×10E10/mL，共得 10 管電感受態(tài)細(xì)胞。

10.將感受態(tài)細(xì)胞全部放入-80℃冰箱待用。注意：不能放在液氮中，否則將喪失電轉(zhuǎn)化能力。

二：電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞（本試劑盒不含相關(guān)試劑）

11.將裝有 70 μL 感受態(tài)細(xì)胞的冷凍管從冰箱取出的、放置在 30℃水浴中快速化凍（快速化凍的效果好于緩慢化凍）。

12.加入 500 ng 左右質(zhì)粒 DNA 并輕柔混勻。

13.迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的、距離為 0.2 cm 的電擊杯中。

14.按電擊儀的手冊設(shè)置電擊參數(shù)并進(jìn)行電擊處理，參考條件為：12.5 kV/cm (對 0.2 cm 的電擊杯，則為 2.5 kV，200 ?，25 μF，相當(dāng)于脈沖長度為 4 ms)。各廠家電轉(zhuǎn)儀器的使用略有不同，請嚴(yán)格按電擊儀廠家提供的手冊進(jìn)行操作。注意：如果爆杯，可能原因一是樣品含有氣泡，可在加樣時(shí)注意避免或稍靜置一會(huì)兒再電轉(zhuǎn)； 二是電轉(zhuǎn)杯未清洗干凈、有雜質(zhì)或老化，可重新清洗或更換電轉(zhuǎn)杯；三是樣品含鹽量較高，可在第 9 步重懸后，離心棄上清并再次用 B 溶液重懸再進(jìn)行后續(xù)操作；四是電壓過高，可將電壓調(diào)整至 2.0 kV，再次嘗試。

15.電擊后迅速將細(xì)胞和 1 mL 預(yù)冷的恢復(fù)培養(yǎng)基（配方見自備物品）輕柔混勻，再轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 的塑料離心管中，30℃靜置厭氧培養(yǎng) 2 小時(shí)。

16.取 0.2 mL 涂盤于含相應(yīng)抗菌素（由質(zhì)粒的抗性基因決定）的 GM17 平板上，30℃ 厭氧培養(yǎng) 1-2 天。

17.觀察并記錄轉(zhuǎn)化子，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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