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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是微量包涵體微量純化試劑盒的中量提取升級(jí)產(chǎn)品，用于中量，快速  的從大腸桿菌宿主細(xì)胞中提取高質(zhì)量的包涵體。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.中量提取，一次可以處理 30-50 mL 的菌液，一次中量提取相當(dāng)于 10-20 次微量提取。

2.操作簡(jiǎn)單快速，整個(gè)過程只要四十分鐘左右。

3.本產(chǎn)品主要用于從大腸桿菌宿主中純化包涵體，也能用于真菌和其他表達(dá)系統(tǒng)  但純化條件（主要是細(xì)胞裂解條件需要自行優(yōu)化）。

4.能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白所占比重達(dá)到 60%以上。

5.本手冊(cè)提供通過酶法裂解細(xì)胞和打斷 DNA 的方案，反應(yīng)更加溫和。

6.得到的包涵體可以用于重折疊。

7.中量包涵體純化試劑盒足夠 5 次中量純化，每次可以處理 30-50mL 菌液。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸及保存，但溶菌-酶和 Benzonase 需要低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

無(wú)

使用方法：

準(zhǔn)備工作：

一次中量提取需要 5 mL 包涵體純化溶液 A，用前按每 mL 加入 120mg 溶菌-酶的比例加入所需量的溶菌-酶干粉并搖晃溶解待用。溶菌-酶的溶液非常容易衰變，  所以最好現(xiàn)配現(xiàn)用，沒用完的只能在-20℃放一周。包涵體中的重組蛋白一般比溶解  狀態(tài)中的蛋白質(zhì)更能夠抵抗微量?jī)?nèi)源性蛋白水解酶的降解，如果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)得到的重  組蛋白確有降解，則需要在包涵體純化溶液 A 中新鮮加入自備的蛋白酶抑制劑混合物。

一．細(xì)胞裂解和包涵體的純化：

1.在蛋白誘導(dǎo)期結(jié)束時(shí)，轉(zhuǎn)移 30=50 mL 菌液到一個(gè)干凈的塑料離心管中。

2.7,000 rpm 室溫離心 3 分鐘，小心棄上清。

3.加入 5 mL 含 120mg/mL 溶菌-酶的包涵體純化溶液 A 重懸細(xì)胞。

4.室溫放置 10-20 分鐘裂解細(xì)菌，其間可以用手輕彈離心管混勻。

5.-20℃冷凍至凝固，一般需要 1 小時(shí)。凝固有利于裂解細(xì)菌，所以一定要凝固到細(xì)菌溶液變成固體。

6.室溫水浴解凍。如果裂解充分，細(xì)菌釋放出的 DNA 將使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，說明裂解不充分，需要重復(fù)凍融步驟，否則完整細(xì)菌將和包涵體一  起沉淀，影響包涵體的純度。最好在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。

7.加入 25 uL 的 Benzonase （1U/uL），脫色搖床上搖晃直到裂解液不再粘稠，一般需要 30 分鐘左右（檢查方式是將裂解物傾倒轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在轉(zhuǎn)移過程中看其是否粘稠）。

8.5,000-7,000 rpm 4℃離心 5 分鐘，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重組蛋白，可以保留作為 SDS-PAGE 對(duì)照樣品。

9.將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在 25 mL 的包涵體純化溶液 B 中，輕柔混勻后室溫放置 5 分鐘。

10.5,000-7,000 rpm 4℃離心 10 分鐘，小心收集上清,可以作為包涵體第一次洗滌的對(duì)照樣品。

11.將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在 25mL 的包涵體純化溶液 B 中，輕柔混勻后室溫放置 5 分鐘。

12.5,000-7,000 rpm 4℃離心 10 分鐘，小心收集上清作為包涵體第二次洗滌的對(duì)照樣品。一般洗滌兩次就能夠得到足夠純凈的包涵體，如果需要更多洗滌，需要用戶單獨(dú)購(gòu)買包涵體洗滌液（包涵體純化溶液 B）。

13.得到的沉淀即為包涵體，可以長(zhǎng)期放置在冰箱待用或直接進(jìn)入包涵體的溶解步  驟。

二．包涵體的溶解

14.在包涵體沉淀中加入 5 mL 包涵體溶解液，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩。如果低溫放置，包涵體溶解液會(huì)產(chǎn)生沉淀，必須 45-65℃溶化并混勻后才能使用。

15.室溫放置 1 小時(shí)使蛋白質(zhì)充分溶解。

16.20000g 4℃離心 20 分鐘，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力。脫鹽處理上清后進(jìn)行 SDS-PAGE 檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有完-全溶解，需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。注意：包涵體溶解液含 6M 鹽酸胍，溶解蛋白能力強(qiáng)于含 8M 尿素的溶解液，但 SDS-PAGE 時(shí)不能直接上樣，需要先脫鹽?？蛻粢部梢杂米詡淠蛩嘏渲?8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不穩(wěn)定，所以不能長(zhǎng)期放置）溶解包涵體，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 電泳。但其溶解能力弱于鹽酸胍。

17.  得到的脫氧后的蛋白質(zhì)溶液可以用于復(fù)性等試驗(yàn)。由于不同的蛋白質(zhì)有不同的優(yōu)良復(fù)性條件，所以本公司不能提供統(tǒng)一的復(fù)性溶液，需要用戶自己摸索。注  意：包涵體純化過程中引入了溶菌-酶、核酸酶 Benzonase 等外源蛋白質(zhì)，在

SDS-PAGE 分析時(shí)可能有額外條帶出現(xiàn)。

選擇我們的中量包涵體純化試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！