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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
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羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀工作原理詳解
一、引言
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）自上世紀(jì)80年代問世以來，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)學(xué)和食品安全等多個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。傳統(tǒng)PCR的終點(diǎn)分析具有一定的局限性，僅能判斷是否擴(kuò)增成功，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控與定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，解決了這一問題。
羅氏公司研發(fā)的 LightCycler® 系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，基于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)與熱循環(huán)技術(shù)，集成了溫控系統(tǒng)、光學(xué)檢測(cè)模塊及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。本文將系統(tǒng)介紹其工作原理、技術(shù)結(jié)構(gòu)及相關(guān)參數(shù)，為理解儀器操作原理和合理使用提供理論依據(jù)。
二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的核心在于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化，通過熒光染料或探針報(bào)告擴(kuò)增產(chǎn)物的累積量，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。
其基本過程包括：
模板擴(kuò)增（DNA復(fù)制）
熒光信號(hào)產(chǎn)生（通過染料或探針）
信號(hào)采集與分析（每一循環(huán)實(shí)時(shí)讀?。?/strong>
1. 擴(kuò)增原理
PCR擴(kuò)增由三個(gè)基本步驟循環(huán)構(gòu)成：
變性（Denaturation）：95°C，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；
退火（Annealing）：50–65°C，引物與模板DNA特異性結(jié)合；
延伸（Extension）：72°C，在Taq酶作用下合成新鏈。
每一輪擴(kuò)增，理論上目標(biāo)序列數(shù)量會(huì)倍增，經(jīng)過30–40個(gè)循環(huán)后即可達(dá)到可檢測(cè)水平。
2. 熒光標(biāo)記方法
熒光定量PCR的實(shí)現(xiàn)依賴于熒光染料或探針系統(tǒng)的加入。目前主要采用以下幾種檢測(cè)體系：
SYBR Green I染料：與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，適用于通用引物體系；
TaqMan探針：結(jié)合目標(biāo)序列后被酶切斷產(chǎn)生熒光釋放，特異性強(qiáng)；
分子信標(biāo)（Molecular Beacon）與Scorpion探針：通過構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)熒光釋放；
FRET探針：兩個(gè)探針之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，用于高特異性檢測(cè)。
3. 熒光檢測(cè)與Ct值概念
每一輪循環(huán)結(jié)束后，設(shè)備通過激發(fā)光照射樣品，記錄熒光強(qiáng)度變化。熒光值超過設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)被稱為Ct（Threshold Cycle），其與起始模板數(shù)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系：
初始模板越多，Ct值越小；
Ct值差異可反映樣品間表達(dá)量差異。
通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或采用ΔΔCt法，可進(jìn)行絕對(duì)或相對(duì)定量分析。
三、羅氏LightCycler® 系統(tǒng)構(gòu)造與功能模塊
羅氏 LightCycler® 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由以下四大模塊構(gòu)成：
1. 溫控系統(tǒng)
構(gòu)造
使用帕爾貼元件進(jìn)行快速加熱與降溫；
96孔金屬模塊與熱蓋形成封閉反應(yīng)環(huán)境；
多點(diǎn)溫度傳感器進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控與調(diào)節(jié)。
功能
確保每一孔溫度一致；
準(zhǔn)確執(zhí)行復(fù)雜的熱循環(huán)程序；
快速升降溫縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高效率。
2. 光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)
光源
多通道激發(fā)光源（如LED）激發(fā)不同熒光染料；
激發(fā)波長(zhǎng)穩(wěn)定，能量可控。
檢測(cè)器
采用光電二極管或光電倍增管；
不同波段濾光片組合可實(shí)現(xiàn)FAM、HEX、ROX、Cy5等染料識(shí)別。
工作流程
在每一循環(huán)結(jié)束后，系統(tǒng)進(jìn)行熒光激發(fā)；
熒光信號(hào)通過光路系統(tǒng)傳輸至探測(cè)器；
同步讀取多個(gè)通道信號(hào)，支持多重檢測(cè)。
3. 樣品托盤與反應(yīng)板
采用標(biāo)準(zhǔn)96孔PCR板，方便兼容市場(chǎng)主流耗材；
熱蓋自動(dòng)調(diào)節(jié)壓力，防止蒸發(fā)；
金屬材質(zhì)確保良好的熱傳導(dǎo)性。
4. 控制與分析系統(tǒng)
通過USB或網(wǎng)絡(luò)接口連接控制計(jì)算機(jī)；
使用 LightCycler® 軟件進(jìn)行程序設(shè)置、數(shù)據(jù)采集與圖像分析；
支持實(shí)時(shí)曲線、熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等功能。
四、典型檢測(cè)流程解析
1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇適合的熒光系統(tǒng)（染料或探針）；
設(shè)計(jì)特異性引物；
準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系（包含模板、引物、酶、dNTP等）；
2. 程序設(shè)置
在軟件中設(shè)定熱循環(huán)程序，包括：
預(yù)變性時(shí)間與溫度；
每步溫度、時(shí)間、循環(huán)次數(shù)；
采集熒光的通道與時(shí)間點(diǎn)。
3. 擴(kuò)增及實(shí)時(shí)檢測(cè)
啟動(dòng)反應(yīng)，儀器自動(dòng)執(zhí)行升降溫與熒光采集；
實(shí)時(shí)生成擴(kuò)增曲線，觀察反應(yīng)動(dòng)態(tài)；
監(jiān)測(cè)不同通道間數(shù)據(jù)變化，判斷是否為特異性擴(kuò)增。
4. 數(shù)據(jù)分析
提取Ct值；
應(yīng)用ΔCt或ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量變化；
生成標(biāo)準(zhǔn)曲線用于絕對(duì)定量；
判斷熔解曲線是否存在非特異產(chǎn)物或引物二聚體。
五、熔解曲線分析原理（適用于SYBR Green法）
在擴(kuò)增結(jié)束后，通過升溫過程記錄雙鏈DNA解鏈產(chǎn)生的熒光下降，得到熔解曲線：
每一個(gè)特異產(chǎn)物對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的熔解溫度（Tm）；
若存在多個(gè)Tm峰，提示可能存在非特異擴(kuò)增或引物二聚體；
可通過曲線平滑、導(dǎo)數(shù)計(jì)算等方式進(jìn)行圖像識(shí)別。
六、影響熒光信號(hào)準(zhǔn)確性的因素
| 因素 | 影響表現(xiàn) | 建議解決方法 |
|---|---|---|
| 熒光染料濃度 | 過高造成背景信號(hào)增加 | 優(yōu)化反應(yīng)濃度 |
| 引物二聚體 | 假陽性Ct值 | 設(shè)計(jì)引物時(shí)避免互補(bǔ)區(qū) |
| 光學(xué)污染 | 信號(hào)不穩(wěn)定或偏差大 | 定期清潔檢測(cè)窗口 |
| 溫控偏差 | 擴(kuò)增效率不均 | 定期校準(zhǔn)溫控模塊 |
七、工作原理的應(yīng)用示例
1. 基因表達(dá)分析
利用qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本豐度，常用于疾病機(jī)制研究、藥效評(píng)估、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等。
2. 病原體檢測(cè)
檢測(cè)病毒DNA/RNA（如SARS-CoV-2、HPV、HBV等），適用于臨床診斷和大規(guī)模篩查。
3. 拷貝數(shù)變異（CNV）分析
通過對(duì)比Ct值計(jì)算基因組中某一區(qū)域的拷貝數(shù)變化，用于腫瘤研究或遺傳病篩查。
八、未來技術(shù)趨勢(shì)
雖然實(shí)時(shí)熒光PCR已趨成熟，但其工作原理不斷被擴(kuò)展與優(yōu)化，主要方向包括：
數(shù)字PCR（dPCR）：基于微液滴分隔的絕對(duì)定量技術(shù)；
微流控PCR芯片：小型化平臺(tái)適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；
自動(dòng)化平臺(tái)整合：與樣品前處理、數(shù)據(jù)云分析系統(tǒng)協(xié)同工作。
九、結(jié)語
羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過整合精確的溫控技術(shù)與多通道光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控與定量分析。其工作原理遵循分子生物學(xué)與物理光學(xué)的基本規(guī)律，構(gòu)建出一個(gè)高效的數(shù)據(jù)生成平臺(tái)。在掌握其原理基礎(chǔ)上，科研人員可更加準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量，并進(jìn)一步拓展其在各類分子分析中的應(yīng)用潛力。
