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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·2年
- 聯(lián)系人：
- 王志文
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- 0571-86288209
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- 地址：
- 杭州市下城區(qū)金通數(shù)字經(jīng)濟(jì)科創(chuàng)園8幢2樓
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- www.shilegeyan.cn
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羅氏LightCycler® 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是實(shí)驗(yàn)室中常用的一款中高通量qPCR平臺(tái)。以下是其標(biāo)準(zhǔn)的使用步驟流程，適用于絕大多數(shù)使用SYBR Green或TaqMan探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增和定量分析的場景：
羅氏LightCycler® 480 使用步驟
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
核酸提取
提取DNA或RNA（如為RNA需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA）
評(píng)估濃度與純度（建議A260/A280介于1.8–2.0）
試劑準(zhǔn)備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案選擇合適的qPCR試劑（如SYBR Green I Master、Probe Master）
準(zhǔn)備引物/探針工作液，確保無氣泡、低溫避光保存
二、反應(yīng)體系配置
標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（以20 µL體積為例）：
| 成分 | 體積（µL） |
|---|---|
| Master Mix | 10 |
| Forward Primer (10 µM) | 0.4 |
| Reverse Primer (10 µM) | 0.4 |
| 探針/染料（如適用） | 0.2 |
| 模板DNA/cDNA | 1–2 |
| 無RNAse水 | 補(bǔ)足至20 µL |
注意：
所有反應(yīng)成分應(yīng)在冰上配置；
引物濃度通常在0.2–0.5 µM之間；
若使用多重qPCR，請(qǐng)確保熒光通道互不干擾。
三、裝板與封板
將反應(yīng)混合液分裝至96孔或384孔反應(yīng)板中；
使用專用光學(xué)封板膜密封反應(yīng)板；
輕壓封膜并離心去除氣泡（例如2000 rpm × 30秒）；
插入LightCycler® 480中指定托架位置。
四、程序設(shè)定（軟件操作）
在LightCycler® 480 Software中設(shè)置PCR程序，以下為常用的SYBR Green法設(shè)定模板：
預(yù)變性：95°C, 10 min
循環(huán)階段（40–45 cycles）：
變性：95°C, 10 sec
退火：60°C, 20 sec（具體溫度依引物而定）
延伸：72°C, 20 sec（有時(shí)與退火合并）
熔解曲線分析（如用SYBR Green）：
95°C, 5 sec
65°C–95°C逐步升溫，每步0.5°C，采集熒光
熒光采集通道：根據(jù)染料選擇通道（如FAM通道用于SYBR或FAM-TaqMan探針）
五、運(yùn)行與監(jiān)控
確認(rèn)熱蓋溫度（一般為105°C）；
啟動(dòng)程序運(yùn)行，期間可實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增曲線；
運(yùn)行時(shí)間約為1.5–2小時(shí)（視程序設(shè)定而定）；
六、數(shù)據(jù)分析
擴(kuò)增曲線查看：確認(rèn)每孔反應(yīng)特征，是否存在拖尾、背景信號(hào)；
Ct值判讀：導(dǎo)出或自動(dòng)生成Ct結(jié)果表；
熔解曲線分析（SYBR Green）：判斷特異性與是否出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；
標(biāo)準(zhǔn)曲線法（如絕對(duì)定量）：生成曲線并計(jì)算拷貝數(shù)；
表達(dá)量分析（如相對(duì)定量）：使用ΔΔCt法比較表達(dá)差異；
七、數(shù)據(jù)導(dǎo)出與保存
可導(dǎo)出
.xls,.pdf,.xml等格式結(jié)果；保存完整項(xiàng)目用于追溯和后續(xù)分析；
建議同時(shí)備份至本地和實(shí)驗(yàn)室服務(wù)器。
八、儀器清潔與維護(hù)
每次使用后清理反應(yīng)板托盤；
定期進(jìn)行光路校準(zhǔn)與溫控驗(yàn)證；
每月檢查熱蓋壓力與熒光通道響應(yīng)；
若長期不使用，建議進(jìn)行關(guān)機(jī)保護(hù)處理。
