生牛乳中富含多種天然活性蛋白，如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳過氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等，這些天然活性蛋白在抵抗細(xì)菌、病毒入侵，增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)組織修復(fù)和生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。其中 α-乳白蛋白具有抗癌、抗菌和抗病毒作用，調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)乳糖合成和乳分泌；β-乳球蛋白具有降膽固醇、抗氧化和抗病毒活性，促進(jìn)脂溶性維生素的消化吸收。不同的熱處理方式（巴氏殺菌、超高溫 (UHT) 滅菌、蒸發(fā)濃縮及噴霧干燥等），會(huì)導(dǎo)致乳制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白出現(xiàn)不同程度的變性失活，從而影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及市場(chǎng)售價(jià)。
賽默飛新行標(biāo)應(yīng)對(duì)方案亮點(diǎn)
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NY/T 4630-2025
賽默飛完整應(yīng)用解決方案
樣品前處理
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儀器配置及色譜條件
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譜圖及數(shù)據(jù)
3.1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù)
圖 1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù) (100 μg/mL)（點(diǎn)擊查看大圖）
如圖 1 所示，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白色譜峰形良好，柱效優(yōu)異，分離度優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)。α-乳白蛋白保留時(shí)間為 21.900 min，不對(duì)稱因子 0.98，理論塔板數(shù) 321137；β-乳球蛋白 B 保留時(shí)間為 24.747 min，不對(duì)稱因子 1.01，理論塔板數(shù) 352451；β-乳球蛋白 A 保留時(shí)間為 25.467 min，不對(duì)稱因子 1.00，理論塔板數(shù) 373359。α-乳白蛋白與 β-乳球蛋白 B 分離度為 17.77，β-乳球蛋白 B 與 β-乳球蛋白 A 分離度為 4.33。
3.2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液定位疊加譜圖
圖 2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液定位疊加譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白單標(biāo)定位色譜圖及光譜圖，如圖 2 所示，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 均在 200 nm 和 279 nm 處有特征吸收。
3.3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣疊加譜圖
圖 3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣疊加譜圖 (100 μg/mL, n=4)（點(diǎn)擊查看大圖）
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (100 μg/mL) 連續(xù)四次進(jìn)樣，保留時(shí)間和峰面積的 RSD 均小于 0.3%，方法重現(xiàn)性好，分離譜圖及數(shù)據(jù)詳見圖 3。
3.4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液校準(zhǔn)曲線疊加譜圖
圖 4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液校準(zhǔn)曲線疊加譜圖 (0.00/40.0/80.0/120/160/200 μg/mL)（點(diǎn)擊查看大圖）
生牛乳、巴氏殺菌乳中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的含量通常都較高，因而選取了 T/TDSTIA 002-2021 和 T/TDSTIA 007-2019 兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)推薦的線性范圍。如圖 4 所示，α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性范圍 0.00-200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù) r2≥0.9997，β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性范圍 0.00-200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù) r2≥0.9991，線性良好。其中 β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 采用化合物組進(jìn)行定量。
3.5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (40.0 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖
圖 5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (40.0 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）
當(dāng)進(jìn)樣體積為 10 uL 時(shí)，以 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白 (40.0 μg/mL) 的峰高為 S，選取 22.5-24.0 min 基質(zhì)噪音的平均值為 N，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 的信噪比 S/N 分別為 523.3、139.9 和 133.6，如圖 5 所示。因此，配合進(jìn)樣體積的優(yōu)化，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白測(cè)定方法靈敏度亦可滿足 NY/T 4630-2025 中 1.00 μg/mL 的要求。
3.6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與巴氏殺菌乳樣品溶液疊加譜圖
圖 6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與巴氏殺菌乳樣品溶液疊加譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）
除乳清蛋白外，牛乳中還含有大量的酪蛋白和其他蛋白，可能會(huì)對(duì) α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的測(cè)定產(chǎn)生干擾。巴氏殺菌乳樣品經(jīng)調(diào)節(jié) pH 、高速離心等前處理操作后，未變性的 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白保留在上清液中，其分離保留的峰型較好、基線平穩(wěn)且出峰時(shí)無(wú)干擾，如圖 6 所示。采用外標(biāo)法定量，巴氏殺菌乳樣品中 α-乳白蛋白為 1033.6 mg/kg和 β-乳球蛋白含量為 2949.0 mg/kg，基本與標(biāo)簽值相符。
3.7 巴氏殺菌乳（低溫奶）、超高溫滅菌乳（常溫奶）及嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)
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α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白對(duì)溫度較敏感，高溫會(huì)破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性。如圖 7-9 所示，巴氏殺菌乳（低溫奶）中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白目標(biāo)峰附近均不存在明顯干擾峰，可準(zhǔn)確定性和定量，生牛乳、巴氏殺菌乳等樣品適用于 NY/T 4630-2025 第一法；而超高溫滅菌乳（常溫奶）和嬰幼兒配方奶粉中 β-乳球蛋白目標(biāo)峰附近存在明顯干擾峰，會(huì)嚴(yán)重影響定性和定量結(jié)果，α-乳白蛋白受影響相對(duì)較小，超高溫滅菌乳、嬰幼兒配方奶粉等樣品不適用于 NY/T 4630-2025 第一法，建議采用第二法。
3.8 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液凝膠滲透色譜圖（第二法）
圖 10 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液 (500 mg/L) 凝膠滲透色譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）
參考杜茹蕓老師在《中國(guó)乳品工業(yè)》期刊發(fā)表的文章《體積排阻色譜法測(cè)定牛奶、乳粉、乳清粉中 α-乳白蛋白的含量》（2022 年），串聯(lián)使用兩支 MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm) 體積排阻色譜柱，以 6 M 鹽酸胍為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，在 280 nm 下可有效分離 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白（如圖 10 所示），并測(cè)試了 60 個(gè)批次的牛奶、奶粉及乳清粉，以驗(yàn)證方法適用性和穩(wěn)定性，相關(guān)譜圖及數(shù)據(jù)詳見原文。
文中選用 MAbPac SEC-1 色譜柱規(guī)格為 7.8×300 mm，推薦流速為 0.5 mL/min，在確保分離度的前提下實(shí)現(xiàn)溶劑節(jié)省，可選用 4.0×300 mm 規(guī)格色譜柱，建議流速為 0.2 mL/min （可酌情適當(dāng)調(diào)整）。
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參考文獻(xiàn)
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