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調(diào)料九里香保衛(wèi)細(xì)胞壁與新鮮馬鈴薯塊莖新局部化淀粉粒的顯微偏振測(cè)定分析

偏振光顯微鏡（PLM）已經(jīng)成為地質(zhì)學(xué)和材料學(xué)領(lǐng)域的常用工具，它通過(guò)使用典型的石英楔補(bǔ)償器、云母1/4波片和Sénarmont補(bǔ)償，在礦物組成和復(fù)合材料（如纖維）結(jié)構(gòu)的測(cè)定方面有著舉足輕重的作用[1]。上述設(shè)備更復(fù)雜的組合方式，或涉及利用定量偏振（借助Berek補(bǔ)償器或Br?ce-K?hler補(bǔ)償器）測(cè)定單個(gè)各向異性晶體或材料的雙折射?；蛘?，可以通過(guò)對(duì)參照Michel Lévy色表觀察到的消光帶和光譜進(jìn)行比較，（事先推斷延遲點(diǎn)的樣品厚度）用紅I（λ）波片測(cè)定透射光波的延遲量（以闡明上述結(jié)構(gòu)的雙折射）[2]。 

盡管如此，目前PLM在生物結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞器研究應(yīng)用上的相對(duì)重要性已經(jīng)下降。相反，基于熒光顯微鏡技術(shù)的方法在生物科學(xué)領(lǐng)域的相對(duì)重要性得以提高，因?yàn)槿藗兂浞终J(rèn)識(shí)到反射熒光技術(shù)（又稱超分辨率顯微鏡技術(shù)）在突破阿貝分辨率極限上的作用，而且標(biāo)記物在熒光蛋白組學(xué)成像中廣泛應(yīng)用、使用方便。在本篇短文（希望它短小精悍）中，我們嘗試評(píng)估顯微偏振測(cè)定法（傳統(tǒng)定量PLM的外推方法）在闡明與鑒別保衛(wèi)細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)和淀粉粒形態(tài)（所述淀粉粒從新鮮馬鈴薯塊莖樣品中分離）方面的應(yīng)用。我們還希望，此后顯微偏振測(cè)定法作為一種分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)將得到認(rèn)識(shí)，并隨著生物科學(xué)和生物影像信息學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展而進(jìn)一步增強(qiáng)?？梢韵胂?，顯微偏振測(cè)定法與反射熒光技術(shù)結(jié)合，將在這種背景下形成共振，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)偏振鏡納米測(cè)量技術(shù)[自行設(shè)計(jì)但非?？扇〉脑坏鞍踪|(zhì)組學(xué)分析的概念，通過(guò)整合定量偏振光顯微鏡（qtPLM）和當(dāng)今的（或未來(lái)的增強(qiáng)版）超分辨率光學(xué)納米顯微鏡技術(shù)平臺(tái)可能會(huì)實(shí)現(xiàn)]的解釋實(shí)現(xiàn)外推。

材料與方法

以新局部化淀粉粒新鮮樣品（從馬鈴薯塊莖橫切面中分離）為本次評(píng)估的陽(yáng)性對(duì)照，源于其來(lái)源豐富、易于制備[對(duì)于透射明視野（BF）和PLM技術(shù)而言]、雙折射程度高且結(jié)構(gòu)充分表征的特點(diǎn)。將其與新鮮制備的調(diào)料九里香（M. koenigii）下表皮（本文稱為遠(yuǎn)端表皮）載玻片（通過(guò)反射PLM觀察）進(jìn)行對(duì)比，并以市售骨骼肌原纖維載玻片（雙折射程度極低，一般無(wú)法通過(guò)Berek和de Sénarmont補(bǔ)償進(jìn)行解析）為qtPLM的陰性對(duì)照（本文不包括該載玻片的觀察結(jié)果）。以HC PL Fluotar 50X/0.80 BD物鏡（徠卡產(chǎn)品代碼：566504）結(jié)合旋轉(zhuǎn)分析器和聚光鏡集成偏振片（用于投射偏振）或者對(duì)應(yīng)的入射光偏振片和史密斯反射立方體（用于反射偏振），進(jìn)行樣品的各向異性鑒別。由于所分析的樣品大體具有高度雙折射特點(diǎn)，因此利用傳統(tǒng)的Berek補(bǔ)償器進(jìn)行偏振度定量分析和對(duì)象延遲量測(cè)定，不過(guò)樣品的對(duì)象延遲量（Γobj）以另外一種方法予以量化（與利用單色光測(cè)定Γobj的傳統(tǒng)方法相反）。（但是）本短文中de Sénarmont和Br?ce-K?hler補(bǔ)償方法并未用于Γobj或雙折射率量化。

結(jié)果

圖1：透射明視野偏振光下未使用補(bǔ)償器（A）及使用相應(yīng)Berek補(bǔ)償器（B）獲得的馬鈴薯塊莖淀粉類圖像。淀粉粒存在明顯的雙折射現(xiàn)象，其Γobj=168.12nm。

圖2：A：反射明視野偏振光下未使用相應(yīng)Berek補(bǔ)償器獲得的調(diào)料九里香保衛(wèi)細(xì)胞（具有內(nèi)陷氣孔）圖像。保衛(wèi)細(xì)胞纖維素細(xì)胞壁出現(xiàn)橙色和黃色多色性（分別以藍(lán)圈和綠圈標(biāo)出），背景為綠黃色的細(xì)胞溶質(zhì)（Γobj=52.69nm）*注：有趣的是，斯托克斯位移拉曼散射和磷光可能被視為解釋這種現(xiàn)象的替代假說(shuō)，在后者中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)纖維素具有自發(fā)熒光現(xiàn)象，在λ=420～430nm處出現(xiàn)最大發(fā)射值[3]）。B：Berek補(bǔ)償PLM成像的保衛(wèi)細(xì)胞細(xì)胞壁立體圖。在細(xì)胞壁外圍觀察到比中部切片更密的纖維素微纖維分布（比如，是標(biāo)藍(lán)圈的保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)的57%/40%=1.425倍）。

討論

正如我們所料，結(jié)果表明馬鈴薯淀粉粒和保衛(wèi)細(xì)胞纖維素細(xì)胞壁在雙折射上存在差異。纖維素和直鏈淀粉（在其被分析的結(jié)構(gòu)中）均以雙折射型多糖大纖維的形式出現(xiàn)；各微纖維的空間排列負(fù)責(zé)使E光相對(duì)于O光移相的距離（Γobj），因此對(duì)所形成的E矢量場(chǎng)的旋度（?×E）產(chǎn)生影響，如下面等式?和?所示（假設(shè)一個(gè)呈正弦曲線形式變化的常數(shù)B）。

假如從樣品發(fā)出的E光和O光振幅（A）相同，其E場(chǎng)分別表示為y軸和z軸。那么，明確具有雙折射特點(diǎn)的樣品[常數(shù)λ和外部補(bǔ)償（若有）為Γcomp]：

其中x表示偏振波在途中經(jīng)過(guò)樣品時(shí)移動(dòng)的距離，Γoc=Γobj+Γcomp。

這樣一來(lái)，（利用自行設(shè)計(jì)且與背景相關(guān)的（但具有廣義性）、用于在R3.5中確定雙折射率的公式）可以推導(dǎo)出?×E，如下所示：

其中可以假定光子的量子空間跳躍分別從y1和z1到y(tǒng)2和z2（其中y1→y0+，z1→z0+，y2→y0-，z2→z0-，Ay或Az=A）。

從上面的等式?可知，在R3.5中?×E的圖是一個(gè)曲線超平面，Γoc在?×E中沿著w軸引入相前平移。正如我們所料，這在視覺上表現(xiàn)為被分析的透射光波（具有不同的Γoc）的交替放大/消光；因此，隨后從?×E圖獲得的w截面可確定dim（?×E）且Γcomp已知的Γobj。但是，如果λ和Γoc可變（常見的例子是在qtPLM下觀察其結(jié)構(gòu)具有不同雙折射率的多色照明樣品，比如圖1和圖2分別顯示的淀粉粒和保衛(wèi)細(xì)胞纖維素細(xì)胞壁），那么我們可以推測(cè)，對(duì)于λ1..n中確定的λa及Γcomp1..n中確定的Γcompa，Γcompa處的dim（?×E），這樣便可解釋樣品中觀察到的多色性（負(fù)衰減的結(jié)果）。

此外，通過(guò)單獨(dú)測(cè)定Γobj和量化圖2中觀察到的多向色分布，或許可以推斷，被評(píng)估的保衛(wèi)細(xì)胞纖維素細(xì)胞壁中主要β（1→4）-糖苷鍵的相對(duì)順序與氣孔長(zhǎng)軸相平行（與皮層微管一樣），表明這些細(xì)胞里纖維素合成酶GT結(jié)構(gòu)域的取向[4]在一定程度上與氣孔短軸相垂直。這與使用顯微偏振測(cè)定法確定圖1中淀粉粒α（1→4）-糖苷鍵徑向取向形成鮮明對(duì)比（這里直鏈淀粉為主要成分）。

結(jié)論

文獻(xiàn)表明，上個(gè)世紀(jì)五十年代至七十年代開展的大量研究中，均涉及顯微偏振測(cè)定法在生物分析方面的應(yīng)用[5],[6]。然而，過(guò)去幾十年偏振光顯微鏡技術(shù)（作為促進(jìn)生物學(xué)研究的要素）的相對(duì)重要性已經(jīng)減弱，而熒光顯微鏡技術(shù)作為一種生物成像平臺(tái)正在興起，并隨著超分辨率光學(xué)顯微鏡技術(shù)和SIM等的發(fā)展而進(jìn)一步發(fā)展。但與需要特定熒光生物標(biāo)記（如共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)和目前的光學(xué)納米顯微鏡技術(shù)中所應(yīng)用的）和/或掃描/光場(chǎng)技術(shù)的情形不一樣，生物PLM為了解未解析分子結(jié)構(gòu)中可能存在的異常提供了一個(gè)途徑。不過(guò)，創(chuàng)建含有關(guān)鍵熱點(diǎn)蛋白質(zhì)（如p53和PrPSc[7]等）新雙折射值的數(shù)據(jù)庫(kù)，可能需要掌握大量的專業(yè)知識(shí)和進(jìn)行大量的工作。因此，在這方面，透射和反射PLM的復(fù)興將相得益彰，其中顯微偏振測(cè)定法可用作傳統(tǒng)qtPLM方法的外推法。

參考文章