目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學試劑>>內(nèi)切酶>> 快速內(nèi)切酶BglII
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | F5591S |
|---|---|---|---|
| 儲存條件 | -20℃ |
產(chǎn)品貨號：F5591s
儲存條件：-20℃
產(chǎn)品組成
組分 | 規(guī)格 |
LabFD™ BglII | 100ul |
10×LabFD™ Buffer | 1ml |
10×LabFD™ Color Buffer | 1ml |
產(chǎn)品簡介
LabFD™快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組、能夠在5~15分鐘內(nèi)精確完成DNA切割的高保真限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或基因組DNA等的快速酶切。LabFD™快速內(nèi)切酶具有如下特點：5~15分鐘內(nèi)即可完成酶切；共用一種酶切Buffer，大大簡化酶切反應(yīng)體系；良好的酶活冗余度，輕松應(yīng)對底物過量或困難模板酶切。此外，LABLEAD去磷酸化、連接試劑在LabFD™酶切Buffer中具有百分之bai活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切-修飾-連接"的體驗。
活性定義
37℃下，在20ul反應(yīng)體系中，1ul酶能夠在15 min內(nèi)*消化1ugλDNA (HindIII digest)。
建議反應(yīng)條件
1×LabFD™緩沖液；
37℃溫育；
參照“DNA快速酶切流程"配制反應(yīng)體系。
失活條件
80℃溫育20min。
質(zhì)量控制
功能活性檢測
最shi反應(yīng)溫度下，在20ul反應(yīng)體系中，1ul LabFD™ BglII能夠在15min內(nèi)*消化1ug λDNA。
超長時間溫育檢測
最shi反應(yīng)溫度下，將1ul LabFD™ BglII與1ug λDNA共同溫育3h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解，延時酶切可能出現(xiàn)星號活性。
酶切-連接-再酶切檢測
最shi反應(yīng)溫度下，使用1ul LabFD™ BglII消化底物，回收酶切產(chǎn)物。在22℃下使用適量Fast T4 DNA Ligase可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。
非特異性內(nèi)切酶活性檢測
最shi反應(yīng)溫度下，將1ul LabFD™ BglII與1ug超螺旋質(zhì)粒DNA共同溫育4h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質(zhì)粒DNA仍然處于超螺旋狀態(tài)。
藍白斑檢測
將含有單一lacZα基因的載體以1ul LabFD™ BglII消化，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布在含有對應(yīng)抗生素、IPTG和 X-gal的LB培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會生長出藍色菌落，而連接錯誤（即DNA末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對于 LabFD™ 系列限制酶而言，白色菌落比例應(yīng)小于 1%。
使用方法
1.DNA快速酶切流程
1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：
質(zhì)粒DNA | PCR產(chǎn)物 | 基因組DNA | |
ddH2O | 15ul | 16ul | 30ul |
10×LabFD™ Buffer或10×LabFD™ Color Buffer | 2ul | 3ula | 5ul |
底物DNA | 2ul(up to 1ug) | 10ul(~0.2ug) | 10ul(5ug) |
LabFD™ BglII | 1ul | 1ul | 5ul |
Total | 20ul | 30ul | 50ul |
注：本體系適用于經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物酶切，未純化的PCR具備一定的離子強度，10xLabFDTMbuffer加入量可適當減少至2ul。但由于DNA聚合酶同時具有外切酶活性，會影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進行克隆等操作，建議酶切前對PCR產(chǎn)物進行純化。
2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；
3）37℃溫育15min（質(zhì)粒），或15~30min（PCR產(chǎn)物），或30~60min（基因組DNA）；
4）80℃溫育20min即可使酶失活，停止反應(yīng)。
2.雙酶切或多酶切
1）每種快速內(nèi)切酶的用量為1ul，并根據(jù)需要適當擴大反應(yīng)體系；
2）所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的1/10；
3.適用于質(zhì)粒的擴大反應(yīng)體系
DNA | 1ug | 2ug | 3ug | 4ug | 5ug |
LabFD™ BglII | 1ul | 2ul | 3ul | 4ul | 5ul |
10×LabFD™ Buffer或10×LabFD™ Color Buffer | 2ul | 2ul | 3ul | 4ul | 5ul |
Total | 20ul | 20ul | 30ul | 40ul | 50ul |
注：如果總反應(yīng)體系大于20ul，應(yīng)適當增加溫育時間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同DNA中的酶切位點數(shù)量
λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 |
6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 11 |
甲基化修飾影響
Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
無影響 | 無影響 | 無影響 | 無影響 | 序列可能重疊 剪切受阻 |
在不同反應(yīng)緩沖液中的活性
LabFD™ Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB CutSmart®Buffer | Takara QuickCut™Buffer | |
活性 | 百分之bai | 百分之bai | 百分之bai | 百分之bai |
注：活性數(shù)據(jù)來自LABLEAD限制酶標準反應(yīng)體系下的檢測。
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