黑色素（melanin）elisa試劑盒操作流程及注意事項(xiàng)

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一、操作流程

1. 試劑準(zhǔn)備

- 提前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃），避免劇烈震蕩。

- 按說明書配制洗滌液（如10×濃縮液需用蒸餾水稀釋）。

2. 樣本處理

- 組織/細(xì)胞樣本：加入裂解液（如RIPA）勻漿，離心（12,000 rpm，10 min）取上清。

- 血清/血漿：離心（3,000 rpm，10 min）去除沉淀，避免溶血或脂血。

- 保存：短期4℃保存，長期需分裝存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋

- 將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋（如0、10、50、100、200 ng/mL），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. 加樣

- 標(biāo)準(zhǔn)孔：依次加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

- 樣本孔：加入處理后的樣本10ul,再加樣本稀釋液40ul,空白孔不加。

- 避免氣泡，每孔換新吸頭以防交叉污染。

5. 孵育

- 37℃孵育30-60分鐘（時間依說明書），避免震動和強(qiáng)光。

6. 洗滌

- 棄液后每孔加滿洗滌液，靜置30秒后倒出，拍干。重復(fù)3-5次，確保充分洗滌。

7. 加酶標(biāo)抗體

- 每孔加入HRP標(biāo)記抗體（按說明書體積），37℃孵育30分鐘，再次洗滌。

8. 顯色

- 加入TMB顯色底物（50-100 μL/孔），避光室溫反應(yīng)10-15分鐘，溶液變藍(lán)色。

9. 終止反應(yīng)

- 加入終止液（如2M硫酸，50 μL/孔），顏色變?yōu)辄S色，立即進(jìn)入檢測。

10. 檢測

- 酶標(biāo)儀450 nm波長測OD值（建議用620 nm雙波長校正背景）。

11. 數(shù)據(jù)分析

- 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度（考慮稀釋倍數(shù)）。

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二、注意事項(xiàng)

1. 試劑與樣本 - 試劑使用前需充分混勻，避免反復(fù)凍融（尤其酶標(biāo)試劑）。

- 樣本避免反復(fù)凍融，處理時防止污染（如蛋白酶或細(xì)菌污染）。

2. 操作細(xì)節(jié)

- 加樣精準(zhǔn)，避免觸碰孔壁或產(chǎn)生氣泡。

- 嚴(yán)格控制孵育時間和溫度，洗滌徹di以防假陽性/陰性。

- 顯色時間需精確，強(qiáng)光下需避光操作。

3. 干擾因素

- 避免使用溶血、脂血或高濃度膽紅素樣本。

- 若樣本濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，需稀釋后復(fù)測。

4. 質(zhì)控與安全

- 每次實(shí)驗(yàn)需重做標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同批號試劑勿混用。

- 終止液含腐蝕性成分，需佩戴手套、護(hù)目鏡操作，廢液按生物危害處理。

5. 設(shè)備與環(huán)境

- 確保酶標(biāo)儀濾光片波長正確，環(huán)境溫度穩(wěn)定（20-25℃）。

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附：常見問題處理 - 高背景：檢查洗滌是否充分或樣本是否過度稀釋。 - 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差：確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋準(zhǔn)確性及酶標(biāo)板密封性。 遵循試劑盒說明書具體步驟，并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化操作。如有異常結(jié)果，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)或聯(lián)系技術(shù)支持。