細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長的過程。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，生化反即刻恢復(fù)。細(xì)胞復(fù)蘇過程升溫要快，原則是慢凍快融，防止在解凍過程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。下面讓我們一起來看看細(xì)胞復(fù)蘇實驗的操作步驟與注意事項吧！
一、操作步驟
1.將10ml移液管、移液槍、1ml槍頭、50ml離心管、T25培養(yǎng)瓶、酒精燈、廢液缸等物品放入超凈工作臺，紫外燈照射30min后再通風(fēng)30min；
2.預(yù)熱培養(yǎng)基；
3.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
4.將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出；
5.放入一次性手套于37℃水浴鍋中快速晃動使其融化；
6.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
7.吸取9ml培養(yǎng)基到50ml離心管中；
8.用1ml槍頭吸取解凍的細(xì)胞懸液于離心管中；
9.1000r/min,離心5min；
10.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
11.吸棄上清液；
12.吸取1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻，并做好標(biāo)記；
13.在顯微鏡下觀察復(fù)蘇的細(xì)胞密度及狀態(tài)；
14.將細(xì)胞放回二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
二、注意事項
1.從液氮罐中取出細(xì)胞時，應(yīng)做好個人防護(hù)以免凍傷；
2.凍存細(xì)胞取出后，如不能立即放入水浴鍋中融化，需將其放在干冰上保存轉(zhuǎn)移；
3.細(xì)胞水浴解凍時間以1min內(nèi)為宜，做到慢凍速融；
4.已解凍的細(xì)胞避免長時間常溫存放，需盡快離心去除DMSO；
5.剛復(fù)蘇的細(xì)胞貼壁尚不牢固，24h內(nèi)不要頻繁觀察和換液；
6.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，并將瓶蓋旋松，以便進(jìn)行充分的氣體交換(如使用透氣性瓶蓋，則無需旋松瓶蓋)。
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