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【產(chǎn)品名稱】 

通用名稱：炭疽桿菌 pagA、cap、rpoB 基因（BaP/C/R）檢測(cè)試劑盒(三重?zé)晒?PCR 法) 

Name：Bacillus Anthracis pagA、cap、rpoB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method) 

【包裝規(guī)格】 50T/盒 

【預(yù)期用途】 炭疽是由炭疽桿菌（Bacillus Anthracis, BA）感染引起的一種人獸共患病。BA 在極-端環(huán)境中形成芽孢，可長(zhǎng)期、穩(wěn)定地存在于自然界中。由于 BA 的穩(wěn)定性及其致病性，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件。目前的 BA 檢測(cè)方法主 要基于病原體的培養(yǎng)、染色鏡檢、血清學(xué)檢測(cè)等，但這些方法均不適合早期的快速偵檢。基于核酸檢測(cè)的熒光-PCR 技術(shù)，因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、特異性好，可快速檢測(cè)炭疽病原，及時(shí)控制炭疽疫情。 本試劑盒采用探針法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，用于水皰內(nèi)容物、病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、 糞便、血液、腦脊液以及增菌液中炭疽桿菌的定性檢測(cè)。

【檢驗(yàn)原理】 本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，對(duì)炭疽桿菌的 pagA、cap、rpoB 的基因分別設(shè)計(jì)特異性 引物和特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)炭疽桿菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】 包裝規(guī)格 50T/盒 BaP/C/R 反應(yīng)液 500μL×2 管 酶液 50μL×1 管 BaP/C/R 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管 陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管 說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。 

【儲(chǔ)存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】 ABI、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。 

【標(biāo)本采集】 炭疽水皰內(nèi)容物、炭疽病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、糞便、血液、腦脊液等；

【保存和運(yùn)輸】 上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。 【使用方法】 

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理 組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)-剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加 入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；咽拭-子樣品直接取 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 核酸提取 推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提 取，請(qǐng)按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)） 根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性質(zhì)控品+1 管陽性質(zhì)控品)，每 測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表： 試劑 BaP/C/R 反應(yīng)液 酶液 用量（樣本數(shù)為 N） 20μL 1μL 將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)） 將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。 4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL； 熒光通道選擇：檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM，Cy5，TXR， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀 器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置： 步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào) 1 1 cycle 95℃ 10min 否 2 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是 

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定 設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像 調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性質(zhì)控品)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷 FAM 通道為 pagA 基因檢測(cè)結(jié)果，Cy5 通道為 cap 基因檢測(cè)結(jié)果，TXR 通道為 rpoB 檢測(cè)結(jié)果； 陽性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線； 可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線， 判定為陽性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示； 陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。 

7. 檢測(cè)方法的局限性

1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)； 

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性質(zhì)控品、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果； 

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。 

【注意事項(xiàng)】 

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染； 

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。